不同铵盐对山豆根组培苗的影响△

范沾涛，刘寒，梁莹，秦双双，韦范，李林轩，陆恒，吴广秀，韦坤华*

1.广西壮族自治区药用植物园 广西药用资源保护与遗传改良重点实验室/广西壮族自治区中药资源智慧创制工程研究中心，广西 南宁 530023；

2.中国药科大学 江苏省中药评价与转化重点实验室，江苏 南京 211198

在植物组织培养领域中，培养基是培养物生长分化的物质基础，其组成成分对培养物生长和次生代谢物的形成和积累有至关重要的影响[1]。培养基中大量元素和微量元素都是生物必需的营养成分，大量元素中的氮是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成部分，在生命活动中占有首要位置，又称生命元素[2]。氮素对植物生命活动及作物产量、品质均有极其重要的影响[3]。硝酸铵是一种重要的氮源，被广泛用作激发剂以刺激植物生长和发育，在受控条件下诱导次级代谢产物[4]，可显著促进叶绿素合成和营养物质积累[5]。MS 培养基是目前广泛应用的植物组织培养基，其重要组分硝酸铵在高温、高压、有可被氧化的物质（还原剂）存在及电火花下会发生爆炸，特别是在生产、贮存、运输、使用过程中，如处理不当或不采取相应预防措施，有可能导致严重的爆炸事故，存在巨大安全隐患。近年来，国家对此类物品的监管越来越严格，其市场流通受到限制，实验室购买硝酸铵的难度很大，给科研和生产带来不便，有必要寻找硝酸铵的替代品。硝态氮（NO3--N）和铵态氮（NH4+-N）是植物吸收的主要氮源[6]，氯化铵、碳酸氢铵、硫酸铵或尿素可能为植物生长提供氮源。因此，本研究以山豆根组培苗为供试材料，评价不同种类铵盐物质对硝酸铵的替代效果。

1 材料

供试材料由广西壮族自治区药用植物园广西药用资源保护与遗传改良重点实验室离体库提供，经广西壮族自治区药用植物园广西药用资源保护与遗传改良重点实验室韦坤华研究员鉴定为山豆根的基原植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep。

LDZX-75KBS 型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；FA2004 型电子天平（上海舜宇恒平科技仪器有限公司）；YP202N 型电子天平（上海舍岩仪器有限公司）；SKIH-1214 型可调式垂直单向洁净工作台（上海天恒医疗器械有限公司）；JZ-II型接种器械灭菌器（济南普朗特生物科技有限公司）；DL91150型数显游标卡尺（宁波得力工具有限公司）；GZX-GF101-1S 型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

硫酸铵（批号：20200116）、氯化钙（批号：20200103）、硫酸镁（批号：20201203）、碘化钾（批号：20210325）、钼酸钠（批号：20200320）、硫酸亚铁（批号：20191203）、乙二胺四乙酸二钠（批号：20200303）、烟酸（批号：20201029）、烟酸硫铵素（批号：20201014）、盐酸吡哆醇（批号：20201025）、甘氨酸（批号：20210311）均购自国药集团化学试剂厂；氯化铵（批号：20210401）、碳酸氢铵（批号：20210104）、尿素（批号：20210115）、磷酸二氢钾（批号：20191206）、硫酸锰（批号：20191108）、硫酸锌（批号：20200112）、氯化钴（批号：20201012）、硫酸铜（批号：20201025）、肌醇（批号：20200915）均购自天津市大茂化学试剂工厂；硝酸铵（批号：20170515）、硝酸钾（批号：20170503）均购自西陇化工股份有限公司；蔗糖（批号：20210413）、硼酸（批号：20201022）均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；6-苄氨基嘌呤（6-BA，批号：B0015K0803011）、吲哚乙酸（IAA，批号：B0012K0323022）、激动素（KT，批号：B0017K0414012）、萘乙酸（NAA，批号：B0018K0321017）、琼脂（批号：B0018K0628001）均购自北京康倍斯科技有限公司。

2 方法

2.1 不同培养基对丛生芽继代增殖的影响

从原丛生芽继代培养基上，取1 簇（含3 个芽）丛生芽接入以下5 种丛生芽继代增殖培养基中，每瓶接种5 簇，每种培养基接种9 瓶，接种后置于温度为（25±2）℃、光照16 h/24 h、光照强度为1500～2000 lx的培养室内培养；40 d 后统计其长叶枝条数（增殖的长叶枝条）、增殖芽苗数和鲜质量。

5 种丛生芽继代增殖培养基：1）对照培养基为MS+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；2）MS2 为MS（20.63 mmol·L-1氯化铵代替硝酸铵）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；3）MS3为MS（20.63 mmol·L-1碳酸氢铵代替硝酸铵）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；4）MS4为MS（20.63 mmol·L-1硫酸铵代替硝酸铵）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；5）MS5 为MS（20.63 mmol·L-1尿素代替硝酸铵）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT。氯化铵、碳酸氢铵、硫酸铵或尿素的用量根据对照培养基MS中铵盐（硝酸铵）的氮量加入。所有培养基中均含30 g·L-1蔗糖和4.5 g·L-1琼脂，pH为5.8～6.0。

2.2 不同培养基对丛生芽壮苗的影响

从原丛生芽壮苗培养基上，取2～3 cm 的茎段接入以下5种丛生芽壮苗培养基中，每瓶接种6株，每种培养基接种9 瓶，接种后置于温度为（25±2）℃、光照16 h/24 h、光照强度为1500～2000 lx 的培养室内培养；40 d 后统计其枝条数（增殖的枝条数）、株高（植株主茎最大高度）、茎粗（植株最下端茎部直径）、叶数（增殖的叶数）和鲜质量。

5 种丛生芽壮苗培养基：1）对照培养基为MS+1.0 mg·L-1IAA；2）MS2为MS（20.63 mmol·L-1氯化铵代替硝酸铵）+1.0 mg·L-1IAA；3）MS3 为MS（20.63 mmol·L-1碳酸氢铵代替硝酸铵）+1.0 mg·L-1IAA；4）MS4 为MS（20.63 mmol·L-1硫酸铵代替硝酸铵）+1.0 mg·L-1IAA；5）MS5 为MS 培养基（20.63 mmol·L-1尿素代替硝酸铵）+1.0 mg·L-1IAA。氯化铵、碳酸氢铵、硫酸铵或尿素的用量根据对照培养基MS 中铵盐（硝酸铵）的氮量加入。所有培养基中均含30 g·L-1蔗糖和4.5 g·L-1琼 脂，pH 为5.8～6.0。

2.3 不同培养基对生根诱导的影响

从原丛生芽壮苗培养基上，取2～3 cm 的顶尖茎段接入以下5 种生根培养基中，每瓶接种6 株，每种培养基接种9瓶，接种后置于温度为（25±2）℃、光照16 h/24 h、光照强度为1500～2000 lx 的培养室内培养；60 d 后统计其叶数（增殖的叶数）、株高（植株主茎最大高度）、平均根长、平均根系直径、平均根干质量和生根率。平均根长、平均根系直径、平均根干质量和生根率按公式（1）～（4）计算。

5 种生根培养基：1）对照培养基为1/2 MS+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；2）MS2 为1/2 MS（10.32 mmol·L-1氯化铵 代替硝酸铵）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；3）MS3 为1/2 MS（10.32 mmol·L-1碳酸氢铵代替硝酸铵）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；4）MS4 为1/2 MS（10.32 mmol·L-1硫酸铵代替硝酸铵）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；5）MS5 为1/2 MS（10.32 mmol·L-1尿素代替硝酸铵）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA。氯化铵、碳酸氢铵、硫酸铵或尿素的用量根据对照培养基1/2 MS 里铵盐（硝酸铵）里的氮量加入。所有培养基中均含30 g·L-1蔗糖和4.5 g·L-1琼脂，pH为5.8～6.0。

2.4 统计分析

采用Microsoft Excel 2016 处理数据，用SPSS 26.0进行方差分析。数据以（）表示，组间比较采用单因素（one-way ANOVA）和最小显著差异（LSD）法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同培养基对丛生芽继代增殖的影响

由表1 和图1 可知，山豆根丛生芽在MS2、MS3、MS4 和MS5 培养基均能继代增殖。在MS4和MS5 培养基上生长的丛生芽在接种20 d 后开始发黄，长势不好，长叶枝条数、增殖芽苗数和鲜质量都显著低于对照组。山豆根丛生芽在MS2和MS3 培养基上生长旺盛，长叶枝条数和增殖芽苗数与对照组相比差异无统计学意义。结果表明，硫酸铵或尿素代替硝酸铵的培养基不适合山豆根丛生芽继代增殖培养，氯化铵或碳酸氢铵代替硝酸铵的培养基适合山豆根丛生芽继代增殖培养。

图1 不同培养基上继代的山豆根丛生芽

表1 不同培养基对山豆根丛生芽继代增殖的影响（,n=5）

表1 不同培养基对山豆根丛生芽继代增殖的影响（,n=5）

注：同列不同小写字母表示P＜0.05；表2～3同。

3.2 不同培养基对丛生芽壮苗的影响

由表2 和图2 可知，MS2、MS3、MS4 和MS5培养基对山豆根枝条数、叶数、株高、茎粗和鲜质量有不同影响。在MS4 和MS5 培养基上生长的山豆根长势不好，枝条数、叶数、株高、茎粗和鲜质量都显著低于对照组。在MS3 培养基上生长的山豆根枝条数与对照组相比差异无统计学意义，然而叶数、株高、茎粗和鲜质量都显著低于对照组。在MS2 培养基上生长的山豆根枝条数、叶数、株高、茎粗和鲜质量与对照组相比差异无统计学意义。结果表明，碳酸氢铵、硫酸铵或尿素代替硝酸铵的培养基不适合山豆根丛生芽壮苗的培养，氯化铵代替硝酸铵的培养基适合山豆根丛生芽壮苗的培养。

图2 不同培养基上山豆根丛生芽壮苗情况

表2 不同培养基对山豆根丛生芽壮苗的影响（,n=5）

表2 不同培养基对山豆根丛生芽壮苗的影响（,n=5）

3.3 不同培养基对生根诱导的影响

由表3 和图3 可知，在MS2 培养基上生长的山豆根生根率最高，其次为对照培养基上生长的山豆根；在MS4 培养基上生长的山豆根平均根系直径最大；对照培养基上生长的山豆根的叶数、株高和平均根长最好。在MS2、MS3、MS4 和MS5培养基上生长的山豆根根干质量显著低于对照组。在MS2、MS3、MS4 和MS5 培养基上生长的山豆根长势差，长出来的根少，叶数、株高和平均根长都显著低于对照组。因此，氯化铵、碳酸氢铵、硫酸铵或尿素代替硝酸铵的培养基不适合诱导山豆根生根。

图3 不同培养基上山豆根生根情况

表3 不同培养基对山豆根生根诱导的影响（,n=5）

表3 不同培养基对山豆根生根诱导的影响（,n=5）

4 讨论

氮素是植物的最基本营养元素，并且是自然陆地生态系统的主要限制性元素，在植物生长过程中的各种生理代谢活动中发挥了十分重要的作用[7-9]。氮元素的施用在植物生态系统过程中会引起多种元素耦合关系效应，对多重化学元素的平衡关系有重要作用[10-12]。是植物吸收氮素的2 种离子形态，大量研究表明，NO3-有利于阳离子运输，NH4+则抑制阳离子运输[13-14]。与单纯的硝态氮相比，硝酸铵的施用可增加作物的干物质积累和蛋白质含量[15]。铵态氮在不同环境胁迫条件下，不同作物品种会引发不尽相同的一系列调节作用[16-17]。氮素是影响植物生长和次生代谢产物积累的重要因素[18]。在MS 培养基中，氮源是重要的组成成分，硝酸铵是培养基中氮元素的主要来源，硝酸铵在MS 培养基中占大量元素质量的36.4%[19]。硝酸铵是危险管制试剂，纯品硝酸铵在市场上禁止流通，这严重影响着组培产业的生存和正常生产，寻找硝酸铵有效替代品非常必要。有研究报道，以尿素代替硝酸铵的培养基不适于苹果、草莓和葡萄组培苗的生长，以硫酸铵代替硝酸铵的培养基中，苹果、草莓和葡萄组培苗生长正常，这3 种植物叶片平展，叶色嫩绿，植物幼嫩组织含水量高，植株生长旺盛[20]。贾思振等[21]研究发现，用硫酸铵代替硝酸铵的培养基不适于火焰南天竹再生。在本研究中，氯化铵、碳酸氢铵、硫酸铵或尿素代替硝酸铵的改良培养基对山豆根组培苗有着不同的影响。硫酸铵或尿素代替硝酸铵的培养基不适合山豆根组培苗的生长。碳酸氢铵代替硝酸铵的培养基适合山豆根丛生芽的继代增殖。氯化铵代替硝酸铵的培养基适合山豆根丛生芽的继代增殖和丛生芽壮苗培养。氯化铵代替硝酸铵的培养基对山豆根诱导生根有很大影响，原因有待进一步研究。氯化铵试剂相对安全、易获取，在缺少硝酸铵的情况下，可将氯化铵代替硝酸铵的培养基用于山豆根丛生芽的继代增殖和丛生芽壮苗培养。