孕产妇生殖道无乳链球菌的血清型分布及耐药基因分析

刘 洁，彭永正,2

(南方医科大学珠江医院 1. 检验医学部； 2. 输血科，广东 广州 510280)

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae，GBS)是孕产妇和新生儿感染的常见病原菌，主要定植在女性下消化道或泌尿生殖道。孕妇妊娠期间身体免疫力降低，母体易感染GBS，引起孕妇流产、早产、胎膜早破、羊膜炎及子宫内膜炎等一系列的妊娠并发症，并通过母婴垂直传播给新生儿，导致新生儿感染，引起新生儿肺炎、血流感染、脑膜炎等严重感染性疾病，甚至导致新生儿死亡[1-3]。近年来，随着抗菌药物的广泛使用，GBS对四环素、红霉素、克林霉素均有不同程度耐药[4]，给临床抗感染治疗带来严峻挑战。本研究分析孕产妇生殖道GBS的血清型、耐药谱及耐药基因，为临床防治GBS感染提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 根据《预防围产期B族链球菌病(中国)专家共识》[5]，选择2020年1月—2021年6月入住某院妊娠晚期且生殖道分泌物检出GBS的孕产妇为研究对象(n=62例)，年龄20～38岁，孕周35～37周。排除习惯性流产、有其他明确感染因素、有严重妊娠并发症及内科疾病的孕妇。研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采用一次性无菌阴道拭子，在受检孕妇阴道下段1/3处旋转1周，收集阴道黏膜分泌物标本，置于无菌试管送检。

1.2.2 病原菌的分离培养、鉴定及药敏检测 按照第四版《全国临床检验操作规范》相关要求，阴道黏膜分泌物接种于血琼脂培养基，置于35℃，5% CO2培养箱中，培养24 h后采用VITEK 2 Compact微生物系统进行病原菌鉴定及药敏试验，药敏结果判定参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2021年的药敏标准[6]。

1.2.3 克林霉素诱导耐药性试验(D试验) 采用K-B纸片琼脂扩散法(K-B法)检测GBS大环内酯类的耐药表型，GBS对红霉素及克林霉素有4个耐药表型[7]：若病原菌对克林霉素和红霉素均表现为耐药，即为内在型(cMLSB)表型；若病原菌对红霉素耐药，且靠近红霉素纸片一侧的克林霉素纸片出现类似字母D的抑菌环，D试验为阳性，即为诱导型(iMLSB)表型；如果病原菌对红霉素敏感或中介，而对克林霉素耐药，即为L型表型；如果病原菌对克林霉素敏感，对红霉素耐药，即为M型表型。

1.2.4 GBS血清分型与耐药基因检测 使用QIAGEN DNA提取试剂盒提取GBS DNA，根据参考文献[8-9]，设计GBS血清分型与耐药基因聚合酶链式反应(PCR)引物序列(见表1、2)。参考Poyart等[8]基于GBS的cps基因差异性建立多重PCR方法，对GBS进行快速、准确地血清型分型。本研究的引物均由擎科生物公司合成，采用PCR扩增法检测GBS血清型与耐药基因，将PCR扩增产物送至擎科生物公司进行测序，并通过BLAST基因数据库进行序列比对分析。

表1 GBS的血清型PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences of GBS serotypes

续表1 (Table 1， Continued)

表2 GBS的四环素、红霉素、克林霉素耐药基因PCR引物序列

2 结果

2.1 GBS不同血清型分布 62株GBS共检出5个血清型，GBS血清型分别为Ⅲ型(30株，48.4%)、Ⅰa型(16株，25.8%)、Ⅰb型(8株，12.9%)、Ⅴ型(6株，9.7%)、Ⅵ型(2株，3.2%)。见图1。

2.2 GBS对常见抗菌药物的药敏结果 GBS对四环素、红霉素、克林霉素有较高的耐药性，耐药率分别为77.4%、71.0%、67.7%，对氨苄西林、青霉素、喹奴普丁/达福普汀、利奈唑胺、万古霉素敏感率为100%，未发现对常见抗菌药物中介的菌株。见表3。

2.3 GBS耐药菌株主要耐药基因检测结果 耐四环素GBS检出tetM 36株(75.0%)、tetO 16株(33.3%)、tetL 2株(4.2%)，耐红霉素GBS检出ermB 32株(72.7%)、mefA/E 10株(22.7%)、ermA 8株(18.2%)、ermTR 6株(13.6%)，耐克林霉素GBS检出linB 18株(42.9%)。见图2。

注：M为DLl 000 Marker，Ⅲ、Ⅰa、Ⅴ、Ⅰb、Ⅵ为对应的血清型基因。图1 GBS血清分型PCR扩增产物电泳图Figure 1 Electrophoresis map of PCR amplification products for GBS serotyping

表3 62株GBS对常见抗菌药物的药敏结果[株(%)]Table 3 Drug susceptibility test results of 62 GBS strains to commonly used antimicrobial agents (No. of isolates[%])

注：M为DL1 000 Marker，tetM、tetO、tetL、ermA、ermB、mefA/E、ermTR、linB为对应的耐药基因。图2 GBS耐药基因PCR扩增产物电泳图Figure 2 Electrophoresis map of PCR amplification products for GBS drug resistance genes

2.4 GBS红霉素和克林霉素耐药表型 耐药表型主要以cMLSB表型为主，占75.0%，其次是M表型(占12.5%)、L表型(占8.3%)、iMLSB表型(占4.2%)。其中cMLSB表型主要由ermB(44.4%，16/36)基因、ermB+linB(27.8%，10/36)基因介导。见表4。

表4 GBS红霉素和克林霉素耐药表型与基因型的关联Table 4 Correlation between erythromycin and clindamycin resistance phenotypes and genotypes of GBS

2.5 GBS不同血清分型中不同抗菌药物耐药基因情况 Ⅲ型血清型携带的耐药基因主要为ermB(66.7%)、tetM(46.7%)、linB(46.7%)、tetO(40.0%)，Ⅰa血清型携带的耐药基因主要为tetM(75.0%)，Ⅰb血清型携带的耐药基因主要为ermB(75.0%)，Ⅴ血清型携带的耐药基因主要为tetM(100%)，Ⅵ血清型携带的耐药基因主要为tetM(100%)。见表5。

表5 GBS不同血清分型中不同抗菌药物耐药基因检出情况Table 5 Detection results of antimicrobial resistance genes in different GBS serotypes

3 讨论

GBS是围产期感染的常见病原菌，常定植在女性下消化道或泌尿生殖道。GBS可以通过产道扩散感染子宫，引起子宫内膜炎和血流感染，并且具有一定的垂直传播率，可以引发早产、胎儿窒息和新生儿严重的感染性疾病[1-3]。近年来，关于GBS引起新生儿感染的报道屡见不鲜，GBS造成的母婴感染逐渐受到医学界关注，成为国内引起孕妇及婴儿感染的重要病原菌。因此，了解GBS血清型、耐药谱及耐药基因，有助于预防和治疗母婴GBS感染。

GBS表面的荚膜多糖是其重要的毒力因子，还可以作为血清学分类的主要依据。因此，了解GBS血清型对确定其致病性非常重要[10]。按GBS上荚膜多糖类型可分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ等10种血清型，其中5种(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ)是GBS的主要类型[11]。本研究根据分子血清分型检出5种血清型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ)，主要为Ⅲ、Ⅰb、Ⅰa(87.1%)血清型，与国内报道[12]的血清型分布和占比(93.0%)基本一致。其他研究[13-14]中不同地区的主要血清型，如巴西Ⅰa、Ⅱ、Ⅰb血清型(65.4%)与加拿大Ⅲ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅴ、Ⅳ血清型(92.9%)，与本研究血清型分布不同。因此，由于不同国家的地域性差异、研究对象的个体特征不同，GBS的血清型分布也存在着空间以及人群差异。报告[15]显示，Ⅲ型血清型在新生儿感染病例中检出更多，其致病性也较其他血清型强。本研究Ⅲ型血清型高达48.4%，应予以重视。GBS的荚膜多糖(CPS)不仅是血清分型的基础，也是疫苗研究的重要靶点。疫苗是预防GBS感染最有效的方式，了解GBS血清型分布对开发基于CPS的多价疫苗至关重要。

根据美国GBS医疗指导方针，GBS对大多数β-内酰胺类抗生素敏感，青霉素是治疗GBS感染的首选药物[5]。本研究显示，GBS对氨苄西林、青霉素的敏感率为100%，故二者可以作为治疗GBS感染的一线用药，但需注意过敏反应。克林霉素与红霉素曾被广泛作为治疗GBS感染的二线用药，然而GBS对克林霉素与红霉素的耐药率逐渐上升，已引起世界范围内的关注，且我国报道的耐药率高于国外相关报道[4,16]。本研究中GBS对克林霉素和红霉素具有高度耐药性，耐药率分别为67.7%、71.0%，建议临床对两者的用药予以重新评价；对四环素的耐药率最高，为77.4%，临床应予以重视。虽然未检测到奎奴普丁/达福普汀、利奈唑胺、万古霉素的耐药菌株，但万古霉素具肝肾毒性，在孕产妇中的使用受到限制，而奎奴普丁/达福普汀及利奈唑胺也不适用于孕产妇的抗感染治疗。因此，针对GBS感染，青霉素可作为一线用药，对青霉素过敏者要做药敏试验，并根据试验结果选择适当抗菌药物，以达到及时、有效的临床疗效。

本研究GBS耐药谱表明，GBS对红霉素、克林霉素、四环素具有不同程度的耐药性。ermA、ermB、ermTR和mefA/E是红霉素耐药基因。erm基因编码的甲基化酶引起核糖体构型改变，使作用于抗菌药物的结合靶位点发生改变，阻碍GBS与红霉素的结合。mef基因编码外排蛋白使病原菌主动将红霉素泵出菌体外，从而产生耐药[17]。本研究显示，对红霉素耐药的GBS菌株主要耐药基因为ermB(72.7%)，提示ermB基因介导的耐药机制可能在GBS耐药中起主导作用。GBS主要耐药表型为cMLSB(75.0%)，与国内外近年来的研究数据基本一致[17-18]。分析cMLSB表型的耐药基因，发现以ermB基因为主。tetM、tetO、tetL和tetK为四环素耐药基因，tetM和tetO编码核糖体保护蛋白，使四环素无法与细菌核糖体结合；tetK和tetL编码外排蛋白，从而产生四环素耐药[19]。本研究中四环素耐药主要由tetM、tetO介导，携带率分别为75.0%、33.3%。克林霉素耐药由编码林可酰胺核苷酸转移酶的linB基因介导，本研究中linB携带率为42.9%。此外，64.5%的GBS同时携带红霉素和四环素耐药基因，主要为ermB和tetM，多种耐药基因的出现可能与耐药基因的水平转移有关。本研究还发现，GBS菌株中存在特定的血清型-耐药基因组合，其中Ⅲ型血清型与ermB基因有关，Ⅰa血清型与tetM基因有关。Ⅲ型血清型与新生儿重症感染密切相关，因此研究血清Ⅲ型GBS的耐药机制更有临床意义。

综上所述，GBS血清型主要以Ⅲ型为主，GBS对四环素、红霉素、克林霉素有着较高的耐药性，四环素耐药以tetM、tetO基因介导为主，红霉素耐药以ermB基因介导的cMLSB型为主，克林霉素耐药以linB基因介导为主。因此，加强对GBS流行病学的监测，有助于更好地了解GBS耐药流行株的发生及传播规律，有助于临床制订防治方案，对预防和控制耐药株的产生极为重要。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。