热疗通过靶向HOXB1诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的研究

刘 威，张 帆，龙永贵

四川省乐山市人民医院胸外科，四川乐山 614000

非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的85%，NSCLC患者总体5年生存率为 17.1%[1]。目前针对肺癌的治疗是手术切除、联合化疗和放疗[2-3]。尽管一些分子靶向药物[如酪氨酸激酶抑制剂 (TKIs)]已应用于治疗表皮生长因子受体 (EGFR) 突变的 NSCLC 患者，但该疾病患者的总生存率仍然不高[4]。因此，需要开发新的治疗策略来改善临床结果。近年来，热疗已被公认为某些癌症(例如NSCLC)的临床治疗方法，可通过射频消融(RFA)等技术诱发[5]。了解热疗作用背后的分子机制也许在一定程度上可以为临床热疗提供进一步的信息。然而，热疗影响NSCLC的确切机制仍未确定。基于此，本研究以NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299为研究对象，旨在探讨热疗调控NSCLC细胞凋亡的潜在机制。

1 材料与方法

1.1材料 NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299购自普诺赛生物公司(货号：CL-0016、CL-0094、CL-0165)。MTT试剂盒购自广州珀西生物科技有限公司(货号：M1020-500T)。Annexin V-FITC Apoptosis Kit购自深圳市文乐生物科技有限公司(货号：K2003-400)。Cellfectin购自宝如亿(北京)生物技术有限公司(货号：10362100)。TRIzol试剂购自杭州新景生物试剂开发有限公司(货号：5301100)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核因子-κB(NF-κB)、同源盒结构基因B1 (HOXB1)、N-α-乙酰转移酶25NatB辅助亚单位蛋白(NAA25)、磷脂转运ATP酶11A (ATP11AUN)、α-甲基酰基-CoA消旋酶(AMACR)、含N-乙酰转移酶结构域蛋白1(NATD1)、含有无菌阿尔法和TIR结构域蛋白1(SARM1)、驱动蛋白家族成员1C (KIF1C)、高尔基相关的含有γ适应素耳的ARF结合蛋白2(GGA2)、激活T细胞的核因子2(NFATC2)的抗体均购自Abcam公司(货号：ab9485、ab28849、ab168279、ab79490、ab105351、ab268062、ab109114、ab226930、ab125903、ab185557、ab2722)。C17orf49的抗体购自赛默飞公司(货号：PA5-55083)。NF-κB luciferase reporter plasmid购自Yeasen公司(货号：11501ES03)。

1.2方法

1.2.1细胞培养与处理 将NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299维持在RPMI-1640培养基中，该培养基含有10%胎牛血清和100 U/mL青链霉素。细胞在含有37 ℃、5%CO2的加湿培养箱中培养。本研究所有转染均使用Cellfectin进行。使用siHOXB1敲低目的基因(序列：正向5′-GAUCCCCUUCUUAGAGUACCCACUUUCAAGAGAAGUGGGUACU CUAAGAAGGUUUUUUA-3′，反向5′-AGCUUAAA AAACCUUCUUAGAGUACCCACUUCUCUUGAAA GUGGGUACUCUAAGAAGGG-3′)，对照为siGFP(GFP序列在人基因组中不存在，故作为阴性对照，序列：正向5′-GCCACAACGUCUAUAUCAUUU-3′，反向3′-UUCGGUGUUGCAGAUAUAGUA-5′)。使用HOXB1过表达质粒过表达HOXB1(克隆于PCDNA3.1质粒)，对照为Vector(PCDNA3.1空载体)。转染前1 d，将NSCLC细胞以5×105细胞/孔的密度铺板在6孔板中，使细胞在转染时生长到 70%～80% 的汇合度。根据制造商的方案，使用 Cellfectin时用上述siRNA或质粒转染细胞。在初始转染后 48～72 h收获NSCLC细胞用于进一步分析。敲低或过表达效果使用免疫印迹检测。

1.2.2细胞活力的检测 为了分析热疗对NSCLC的影响，首先在37、40、43 、46 ℃的温度下处理NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299 40 min。随后，将细胞在 37 ℃、5%CO2的环境中再培养24 h，并且使用MTT法测定、评估细胞活力。

1.2.3细胞凋亡水平的检测 为了确定用热疗处理的NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299是否发生凋亡，热疗处理细胞24 h后用Annexin V-FITC 和PI对细胞进行染色，通过流式细胞术评估NSCLC细胞的凋亡水平。细胞凋亡定义为Annexin V阳性和 PI 阳性。

1.2.4高通量测序 RNA-seq由睿博公司进行。用 TRIzol试剂提取37 ℃和43 ℃处理的NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299的总 RNA。根据制造商的说明，使用 TruSeq Small RNA Library Prep 试剂盒构建 RNA 测序文库。RNA 在 Illumina HiSeqTM2500 测序仪上进行单端测序。 使用R软件中的“edgeR”包分析 RNA-seq 数据。使用|log2(倍数变化)| ≥1的阈值过滤差异表达谱，且P<0.05。

1.2.5NF-κB活性的检测 NF-κB luciferase reporter plasmid中插入了多个NF-κB的结合位点，激活的NF-κB可以结合质粒上的元件进行荧光素酶的转录、翻译，因此可以通过荧光素酶活性检测NF-κB的活性。将NF-κB luciferase reporter plasmid转染NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299后，在43 ℃时裂解细胞并检测luciferase活性。

1.2.6免疫共沉淀与免疫印迹 使用免疫共沉淀试剂盒检测HOXB1与NF-κB之间的相互作用。用 RIPA 裂解缓冲液收集43 ℃时NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299中的蛋白质，并补充有苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。用二辛可宁酸(BCA)法测定上清液中的总蛋白含量，适当质量蛋白的变性蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后电转移到 PVDF 膜，使用抗GAPDH的抗体、抗NF-κB的抗体和抗HOXB1的抗体在 4 ℃ 下过夜。通过增强化学发光(ECL)试剂盒观察蛋白质条带。

2 结 果

2.1在37、40、43、46 ℃条件下NSCLC细胞的活力和凋亡水平 相比于37 ℃，NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299在40、43、46 ℃下的活力均显著降低(P<0.05)，凋亡水平均显著上升(P<0.05)。相比于37、40、46 ℃，NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299在43 ℃的凋亡水平显著上升(P<0.05)。见表1、表2、图1。

注：A表示在37、40、43、46 ℃条件下A549细胞系的细胞活力；B表示在37、40、43、46 ℃条件下HCC827细胞系的细胞活力；C表示在37、40、43、46 ℃条件下NCI-H1299细胞系的细胞活力；D表示在37、40、43、46 ℃条件下A549细胞系的细胞凋亡水平；E表示在37、40、43、46 ℃条件下HCC827细胞系的细胞凋亡水平；F表示在37、40、43、46 ℃条件下NCI-H1299细胞系的细胞凋亡水平；与37 ℃比较，*P<0.05。

表1 在37、40、43、46 ℃条件下NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299的细胞活力

表2 在37、40、43、46 ℃条件下NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299的细胞凋亡水平

2.243 ℃条件下诱导HOXB1表达对NSCLC细胞凋亡的影响 将37 ℃和43 ℃处理的NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299进行转录组高通量测序，发现有10个基因在这3个细胞系中均受到调控，分别是NAA25、HOXB1、ATP11AUN、AMACR、NATD1、SARM1、C17orf49、KIF1C、GGA2、NFATC2。使用相应的siRNA分别敲低上述基因后，与siGFP组比较，发现敲低HOXB1后，43 ℃时NSCLC细胞系A549的凋亡水平下降(P<0.05)，见图2A。同时，与siGFP组比较，敲低HOXB1后，43 ℃时NSCLC细胞系HCC827、NCI-H1299的凋亡水平下降(P<0.05)，见图2B和图2C。与Vector组比较，过表达HOXB1后，37 ℃时NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299的凋亡水平上升(P<0.05)。见表3～5和图2D～F。

注：A表示siRNA敲低筛选影响43 ℃条件下A549细胞凋亡水平的基因；B表示敲低HOXB1后，43 ℃条件下HCC827细胞的凋亡水平；C表示敲低HOXB1后，37 ℃条件下NCI-H1299细胞的凋亡水平；D表示过表达HOXB1后，37 ℃条件下A549细胞的凋亡水平；E表示过表达HOXB1后，37 ℃条件下HCC827细胞的凋亡水平；F表示过表达HOXB1后，43 ℃条件下NCI-H1299细胞的凋亡水平；与siGFP组或Vector组比较，*P<0.05。

表3 siRNA敲低筛选影响A549在43 ℃时凋亡水平的基因

表4 敲低或不敲低HOXB1后NSCLC细胞系HCC827、NCI-H1299在43 ℃时的凋亡水平

2.3HOXB1通过NF-κB对NSCLC细胞凋亡的影响 见表6。与siGFP组比较，敲低HOXB1后，43 ℃时NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299中荧光素酶活性上升，因此敲低HOXB1后NF-κB的活性上升(P<0.05)，见图3A、图3B和图3C。同时，43 ℃条件下，免疫共沉淀通过HOXB1抗体能够结合NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299的NF-κB，见图3D。

表5 过表达或不过表达HOXB1后，NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299在37 ℃时的凋亡水平

表6 敲低或不敲低HOXB1后，NSCLC细胞系HCC827、NCI-H1299在43 ℃时的NF-κB活性 (荧光素酶活性值，

注：A表示敲低HOXB1后，43 ℃条件下A549细胞中NF-κB的活性；B表示敲低HOXB1后，43 ℃条件下NCI-H1299细胞中NF-κB的活性；C表示敲低HOXB1后，43 ℃条件下HCC827细胞中NF-κB的活性；D表示43 ℃条件下A549、HCC827、NCI-H1299细胞中HOXB1与NF-κB亚基p65的相互作用；与siGFP组比较，*P<0.05。

3 讨 论

最近，术后热疗已被用作重要的辅助治疗手段，以提高传统化疗和(或)放疗的疗效[6]。由于过去的技术无法在不损伤周围非肿瘤组织的情况下有效且均匀地向肿瘤部位传递热量，因此现代医学研究中热疗的发展相对过时[7]。但是，最近直接应用热处理的新技术(如计算机建模和无创测温)使热疗成为新的治疗肿瘤方案[8]。许多临床数据表明，微波 (MW) 消融可以改善肝细胞癌、结直肠癌肝转移和复发性结直肠癌肺转移患者的肿瘤学结果[9]。MW热疗(温度通常在 42～45 ℃)已广泛用于浅表肿瘤的临床试验[10]。因此，本研究选择在37、40、43、46 ℃下处理NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299。相比于37 ℃，NSCLC细胞系在40、43、46 ℃下的活力均显著降低(P<0.05)、凋亡水平均显著上升(P<0.05)。相比于37、40、46 ℃条件下，NSCLC细胞系在43 ℃的凋亡水平显著上升(P<0.05)。因此，热疗可以与放疗和化疗有效结合使用，以促进机体免疫反应对抗靶肿瘤。

同源盒 (HOX) 基因编码一个转录因子家族，这些因子可以与靶基因序列结合以调节靶基因的表达水平[11]。HOXB1是HOX 家族的重要成员，多项研究表明HOXB1是包括癌症在内的许多疾病发展的重要调节因子[11-14]。本研究发现敲低HOXB1后，43 ℃时NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299的凋亡水平下降(P<0.05)。因此，HOXB1是一个受热疗调控的抑癌因子，有望成为治疗NSCLC的新靶标。

有研究报道HOXB1能够抑制NF-κB信号通路的活性[15]。因此，为了检测HOXB1的促凋亡作用是否与NF-κB信号通路相关，本研究检测了敲低HOXB1后NF-κB的活性。与siGFP组比较，敲低HOXB1后，43 ℃时NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299中荧光素酶活性上升，因此敲低HOXB1后NF-κB的活性上升(P<0.05)。因此，HOXB1能够抑制NF-κB信号通路的活性。同时，43 ℃时NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299中NF-κB能够与HOXB1相互作用。NF-κB是一种多功能转录因子，是NF-κB/Rel 蛋白家族的成员[16]。哺乳动物有5个亚基，但最常见的形式是p65/p50二聚体复合物，它在炎症反应、调节细胞增殖和凋亡中起重要作用[17]。NF-κB能够通过抑制促凋亡因子Bax的表达来抑制凋亡[18]。因此，HOXB1可能与基因组中NF-κB靶向的元件竞争性地结合NF-κB以抑制NF-κB活性，最后促进了NSCLC细胞凋亡。

综上所述，热疗处理NSCLC细胞后，HOXB1的表达水平上升，HOXB1可与NF-κB结合并抑制NF-κB的活性，促进了细胞凋亡。