VEGF、FGF2 及ER 在术前内痔粘膜中的分布特征及其临床意义

陈孟君 梁永强 袁燕文

痔疮分为内部和外部，是一种相当常见的疾病，尽管一直以来都试图阐明其病理生理学，以治愈、改善患者的生活质量，然而该疾病的许多方面仍然难以捉摸［1］。其中内痔常见于45～65 岁人群中，因其为良性疾病，所以并未引起人们足够的重视，有关内痔病理学研究相对较少，分子学机制等也尚未明确，其中“静脉曲张”、“血管增生”、“肛垫下移”等学说是目前内痔形成与发展的主要机制理论［2］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）属于新生血管形成因子，可促进血管内皮的分化与增殖［3］，碱性成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）可促进细胞有丝分裂及血管生成［4］，雌激素受体（estrogen receptor，ER）在血管生成调控中起到促进作用［5］。本研究通过检测Ⅲ、Ⅳ分度内痔患者术前内痔黏膜VEGF、FGF2、ER 表达，探讨术前内痔粘膜中的分布特征，旨在进一步阐明内痔发生的分子机制，为临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年10 月至2021 年11 月于东莞市人民医院就诊的Ⅲ、Ⅳ分度的内痔患者96 例作为研究对象，Ⅲ分度的内痔患者为Ⅲ度组（n=50）、Ⅳ分度的内痔患者为Ⅳ度组（n=46），以及选取同期体检志愿者35 名非痔患者作为正常组。内痔患者纳入标准：①符合《痔临床诊治指南（2006 版）》［6］中内痔诊断标准；②年龄20～75 岁；③Ⅲ、Ⅳ分度并符合手术指征；④患者及其家属均知情同意本研究。排除标准：①无法耐受像关治疗并中途终止治疗者；②合并凝血功能障碍患者；③存在恶性肿瘤或其他重要器官功能障碍患者；③哺乳期或妊娠期患者。正常组为正常肛垫患者。Ⅲ度组男31 例，女19 例，平均年龄（42.52±6.41）岁，平均病程（5.72±2.43）年，BMI（25.79±3.34）kg/m2，既往治疗0 次12 例、1 次20 例、2 次18 例；Ⅳ度组男28 例，女18 例，平均年龄（43.41±6.58）岁，平均病程（5.33±3.17）年，BMI（25.56±4.24）kg/m2，既往治疗0 次9 例、1 次26 例、2 次11 例；正常组男18 名，女17 名，平均年龄（44.72±8.11）岁，BMI（24.83±2.34）kg/m2，三组性别比例、年龄、BMI 等差异无统计意义（P＞0.05）。本研究经院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 试剂与设备

苏木素、伊红染色液（四川维克奇生物科技有限公司），VEGF、ER 抗体（德国默克公司），FGF2 抗体（ABclonal 公司），羊抗兔免疫球蛋白IgG 抗体（德国默克公司），DAB 显色液（福州迈新生物科技有限公司）；18596W6WEE 生物显微镜（德国Leica 公司），HS-S7220-B 电动石蜡切片机（广东恒松科技有限公司），胃肠功能检测系统挤压力换能器（瑞典Medtronic-Synectic 公司）。

1.2.2 组织病理学检查

所有标本均有病理科常规固定取材后，进行脱水、石蜡包埋等处理，根据分度及正常肛垫进行编号，采用组织切片机进行连续切片，在采用HE染色，于生物显微镜下观察。

1.2.3 免疫组化检测

采用免疫组化法检测各组VEGF、FGF2 及ER 表达与分布。将组织石蜡片置于65℃烤箱中90 min 后进行脱蜡，修复3 次后加入山羊血清，37℃保温性中封闭30 min 后加入一抗，VEGF、FGF2、ER 抗体，保湿4℃过夜，再加入羊抗兔免疫球蛋白IgG 抗体温室孵育20 min，应用PBS 液进行洗片2 min，共洗3 次，避光，加入DAB 显色剂至覆盖组织切片，显微镜下观察，棕黄色显色后用蒸馏水终止，1 min，加入苏木素进行细胞核染色，1 min，蒸馏水冲洗至蓝色，采用乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，在显微镜下进行观察，其中褐色则为阳性表达，采用图像分析软件进行灰度（IOD）值测量。

1.2.4 临床特征检测

采用胃肠功能检测系统挤压力换能器对患者肛管静息压（anal canal resting pressure，RASP）、肛管收缩压（anal canal resting pressure，MASP）、直肠感知阈值（rectal perceptual thresholds，RSTV）、直肠最大容量阈值（rectal maximum volume threshold，RMTV）进行检测。

1.3 统计学方法

本研究采用SPSS 21.0 软件进行数据分析。计量资料用（±s）表示，两组间比较用t检验，多组间比较用F检验，进一步两两比较使用SNK-q 检验；计数资料用n（%）表示，比较用χ2检验；采用Pearson相关性分析法进行相关性分析；P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病理组织特点

正常组的肛垫组织黏膜层被覆盖的上皮厚度均匀、完整，无明显的出血以及血管增生，Trietz 肌纤维聚集且平行排列，形态较为规则，弹性纤维多。见图1A。内痔组织黏膜层被覆盖的上皮呈连续性的破坏、糜烂甚至溃烂，黏膜厚度不均匀，黏膜以及黏膜的下层或可见炎症浸润，组织可见明显的弥漫性出血，血管扩张且数量增多，可见血管腔形成在或新鲜或陈旧的血栓，Trietz 肌排列紊乱疏松，纤维缺乏弹性，肌纤维有断裂或变性。见图1B。

图1 组织病理学检查（HE 法，×100）Figure 1 Histopathological examination（HE，×100）

2.2 正常组肛垫与与不同程度内痔患者黏膜VEGF、FGF2 及ER 染色表现及表达水平比较

与正常组比较，内痔黏膜微血管内皮细胞中具有明显的棕褐色染色，正常组肛垫细胞质内没有或仅有少量棕黄色可沉淀。内痔Ⅲ度组与Ⅳ度组VEGF、FGF2 及ER 表达水平均高于正常组的表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05）；Ⅳ度组的VEGF、FGF2 及ER 表达水平高于Ⅲ度组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 正常组肛垫与不同程度内痔患者黏膜VEGF、FGF2 及ER 表达水平比较（±s）Table 1 Comparison of mucosal VEGF，FGF2 and ER expression levels between anal pads from normal subjects and patients with internal hemorrhoids of various degrees（±s）

表1 正常组肛垫与不同程度内痔患者黏膜VEGF、FGF2 及ER 表达水平比较（±s）Table 1 Comparison of mucosal VEGF，FGF2 and ER expression levels between anal pads from normal subjects and patients with internal hemorrhoids of various degrees（±s）

注：与正常肛垫组比较，aP＜0.05；与内痔Ⅲ度患者比较，bP＜0.05。

组别正常组Ⅲ度组Ⅳ度组F 值P 值n 35 50 46 VEGF 25.55±5.62 83.71±8.56a 112.74±15.46ab 636.745 0.000 FGF2 50.19±8.69 99.87±9.76a 121.43±13.45ab 430.832 0.000 ER 15.83±4.42 31.51±6.22a 52.46±8.87ab 288.301 0.000

2.3 各组临床特征值比较

内痔Ⅲ度组与Ⅳ度组RASP 水平高于正常组、Ⅳ度组高于Ⅲ度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；MASP 水平低于正常组，Ⅳ度组低于Ⅲ度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组RSTV、RMTV 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组RASP、MASP、RSTV、RMTV 水平比较（±s）Table 2 Comparison of rasp，masp，rstv，and rmtv levels in each group（±s）

表2 各组RASP、MASP、RSTV、RMTV 水平比较（±s）Table 2 Comparison of rasp，masp，rstv，and rmtv levels in each group（±s）

注：与正常肛垫组比较，aP＜0.05；与内痔Ⅲ度患者比较，aP＜0.05。

RMTV（mL）218.58±36.42 216.53±34.66 214.60±37.17 0.122 0.885组别正常组Ⅲ度组Ⅳ度组F 值P 值n 35 50 46 RASP（mmHg）31.56±10.42 64.74±11.14a 78.79±12.85ab 169.60 0.000 MASP（mmHg）162.44±17.85 144.86±33.86a 125.83±29.76ab 16.145 0.000 RSTV（mL）56.74±16.96 61.52±17.78 63.92±16.98 1.740 0.180

2.4 患者内痔黏膜VEGF、FGF2 及ER 表达水平与RASP、MASP 的关系

VEGF、FGF2 表达水平与RASP 呈正相关、与MASP 呈负相关（P＜0.05）；ER 表达水平与RASP、MASP 均无显著相关性（P＞0.05）。见表3。

表3 患者内痔黏膜VEGF、FGF2 及ER 表达水平与RASP、MASP 的相关性Table 3 Correlation of VEGF，FGF2 and ER expression levels with rasp and masp in internal hemorrhoidal mucosa of patients

3 讨论

根据脱垂程度，内痔可以进一步分为Ⅰ至Ⅳ级［7］。痔疮可以通过内科和外科手术进行治疗，具体取决于它们的脱垂程度以及它们是内部还是外部，Ⅲ级或Ⅳ级痔疮最有效的治疗方法是手术切除。“血管增生学说”是内痔发生机制的主要学说之一［8］。目前利用分子生物学研究机制的方法已经逐渐成为医学领域的主流［9］。

本研究对正常肛垫及内痔黏膜组织病理学形态观察比较，结果显示，正常组的肛垫组织黏膜层被覆盖的上皮厚度均匀、完整，无明显的出血以及血管增生，Trietz 肌纤维聚集且平行排列，形态较为规则，弹性纤维多。内痔组织黏膜层被覆盖的上皮呈连续性的破坏、糜烂甚至溃烂，黏膜厚度不均匀，黏膜以及黏膜的下层或可见炎症浸润，组织可见明显的弥漫性出血，血管扩张且数量增多，可见血管腔形成在或新鲜或陈旧的血栓，Trietz 肌排列紊乱疏松，纤维缺乏弹性，肌纤维有断裂或变性。正常肛垫的结构与功能的震颤，需在血管与纤维结蹄组织的共同作用下维持，而病理情况下的肛垫组织，黏膜较薄，Trietz 肌的固定与支持作用遭到破坏，痔区的血管受到的约束降低，从而引起肛垫充血肥大甚至导致内痔脱垂等［10］。

同时，本研究对内痔粘膜VEGF、FGF2 及ER在术前的分布情况进行分析，结果显示，VEGF、FGF2 与ER 在内痔黏膜血管内皮细胞中呈高表达状态，表明VEGF、FGF2 与ER 的表达与内痔垫的微血管生成有关。VEGF 具有重要促血管生成活性的生长因子，对内皮细胞具有促有丝分裂和抗凋亡作用，增加血管通透性，促进细胞迁移等［11］。FGF2 代表FGF 家族的原型成员，能够在体外诱导内皮细胞中的复杂“血管生成表型”，促炎和血管生成信号之间的紧密相互作用，能够在体内诱导强有力的新血管反应［12］。VEGF 和FGF-2 是最强的血管生成激活剂，其刺激现有血管中内皮细胞的迁移和增殖以产生和稳定新血管［13］。作为类固醇激素，雌激素在血管病理学方面获得了广泛的关注，ER 是雌激素的细胞受体，其可通过炎症调节血管系统，调节平滑肌细胞增殖、血管张力和新生血管［14］。在内痔的生成过程中，血管内皮细胞增殖，可促进血管的生成，因此可诱导黏膜下的血管增生同时产生曲张、扩张等情况，同时各种炎症因子从管壁渗出，造成局部的炎症细胞增殖，黏膜开始发生溃烂，因此痔疮反复加重或不愈。本研究中VEGF、FGF2 表达水平与RASP 呈正相关、与MASP 呈负相关，可能与VEGF、FGF2在内痔黏膜组织中的高表达导致肛垫血管过度增生，从而导致患者RASP 的升高、MASP 的降低［15］，而此作用可能为内痔临床症状的发生与发展的机制之一。

综上所述，VEGF、FGF2 及ER 在内痔垫的微血管的生成与发展具有重要作用，VEGF、FGF2 与患者临床表现存在相关性，为临床的治疗提供实验依据。