复方七芍降压片对SHR大鼠内皮细胞线粒体自噬和炎症应激的影响*

曹彦花， 雍苏南， 李苏**， 乐金海， 李俊， 王忠良， 刘梅， 刘慧

(1.湖南中医药大学第一附属医院 心血管科， 湖南 长沙 410021； 2.长沙市中医医院 骨伤科， 湖南 长沙 410000； 3.长沙医学院 基础医学院， 湖南 长沙 410219； 4.长沙医学院 临床医学院， 湖南 长沙 410219； 5.长沙医学院 公共卫生学院， 湖南 长沙 410219)

高血压是全球广泛流行的慢性疾病，全球患病率逐年增加大约10%，可显著增加心血管病及靶器官损害风险[1]。目前将无法明确病因的高血压称为原发性高血压(essential hypertension，SHR)，SHR患者血管内皮存在明显的功能障碍，内皮细胞线粒体自噬障碍可能是启动微血管床病理生理改变的主要内因，而衍生出β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂等临床西医降压药[2]。长期使用西医降压药，部分患者有明显的头晕或恶心症状，耐药性也比较常见[2]。复方七芍降压片是用于肾阴虚、瘀血阻络型高血压患者的常用药物，能改善SHR而导致的动脉内膜粗糙、管壁增厚，缓解炎症介质对血管内皮的损伤，可有效逆转血管异常增生[3]。研究指出，哺乳动物体内的促炎、抗炎系统持续处于动态平衡中，其反应程度直接决定了血管损伤的修复效果，复方七芍降压片发挥降压效果的机制则可能与其减少炎症介质释放有关[4-5]，但其干预SHR的具体机制尚无定论，本研究探讨其对内皮细胞线粒体自噬、炎症应激损伤的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物和材料

1.1.1实验动物 50只8周龄SPF级Wistar雄性SHR大鼠购自北京维通利华实验动物公司[许可证书SCXK(湘)2019-214]，体质量210～250 g，分笼饲喂(每笼10只)，饲喂室温(24.0±2.0)℃，相对湿度(60.0±5.0)%，昼夜交替(各12 h)，常规饲养7 d后开始实验。

1.1.2主要仪器和试剂 AUW2200分析天平(日本岛津)、BP98A无创血压计(北京软隆生物技术有限公司)、CKX53倒置显微镜(日本奥林巴斯)、WH-866旋涡振荡器(江苏太仓华利达实验室设备公司)、MK3多功能酶标仪(中国赛默飞世尔仪器有限公司)、DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱等，大鼠丙二醛(MDA)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒购自欣博盛公司，苏木精(国药沪试，批号71020782)、伊红Y (国药沪试，批号71014544)、组织线粒体分离试剂盒(上海碧云天生物公司)等。

1.1.3主要药物 复方七芍降压片(湖南中医药大学第一附属医院药剂科，批号20190111)，厄贝沙坦(杭州赛诺菲制药有限公司，批号5A159)等。

1.2 研究方法

1.2.1造模及干预 无菌条件下结扎大鼠双肾动脉下极分支，采用高脂高盐饲料喂养60 d，以制备高血压模型，造模结束在大鼠安静、清醒条件下测量尾动脉血压，单日随机重复检测3次，取成功造模大鼠进行后续实验[4]。采用随机数字表，将大鼠均分为空白组[予10 mg/(kg·d)生理盐水灌胃]、阳性对照组[予10 mg/(kg·d)厄贝沙坦灌胃]及复方七芍(低、中、高)剂量组[分别予5、10、20 mg/(kg·d)复方七芍降压片灌胃]， 1次/d、连续30 d。

1.2.2组织处理 干预30 d时用乙醚麻醉大鼠，颈椎脱臼法处死，取20 mg腹主动脉组织置入EP管，用PBS洗净残留血液，冰上剪碎(1 mm×1 mm)，4 ℃ 3 000 r/min转离心12 min，取上清液待检。

1.2.3观察指标 (1)内皮细胞线粒体功能相关蛋白：采用western blot法检测，腹主动脉内皮细胞加入组织裂解液、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂，匀浆静置后再次离心30 min；变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，依次经过转膜、封闭、抗体孵育、二抗孵育等步骤，用Bio-Rad凝胶成像系统采集PINK1、Parkin、LC3蛋白印迹信号[6-7]。(2)氧化损伤和炎症损伤相关指标用黄嘌呤氧化酶酸法检测MDA、SOD、CAT，用ELISA法检测IL-1β、TNF-α、NO)[8-9]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 腹主动脉内皮细胞PINK1、Parkin、LC3蛋白含量

干预后，阳性对照组、复方七芍各剂量组大鼠腹主动脉内皮细胞PINK1、Parkin、LC3蛋白高于空白组，复方七芍各剂量组低于阳性对照组，其中复方七芍低剂量组>中剂量组>高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 干预后各组大鼠腹主动脉内皮细胞线粒体功能相关蛋白含量比较Tab.1 Comparison of mitochondrial function-related protein contents in endothelial cells in SHR abdominal aorta tissues after treatment in each

2.2 腹主动脉组织内皮细胞SOD、CAT、IL-1β、TNF-α、NO含量

干预后，阳性对照组、复方七芍各剂量组大鼠腹主动脉组织内皮细胞MDA、IL-1β、TNF-α、NO含量高于空白组，复方七芍各剂量组低于阳性对照组，复方七芍低剂量组>中剂量组>高剂量组(P<0.05)。各组大鼠腹主动脉内皮细胞SOD、CAT含量比较，阳性对照组、复方七芍各剂量组大鼠低于空白组，复方七芍各剂量组高于阳性对照组，其中复方七芍低剂量组<中剂量组<高剂量组(P<0.05)。见表2。

2.3 氧化、炎症指标与线粒体功能相关蛋白含量的相关性

对照组、阳性对照组、剂量组大鼠PINK1、Parkin、LC3蛋白含量与MDA、IL-1β、TNF-α、NO含量呈正相关，与SOD、CAT含量呈负相关。见表3。

表2 各组大鼠腹主动脉内皮细胞氧化损伤和炎症损伤相关指标比较Tab.2 Comparison of related indexes of oxidative injury and inflammatory injury in endothelial cells in SHR abdominal aorta tissues in each

表3 SHR模型大鼠内皮细胞氧化、炎症指标与线粒体功能相关蛋白含量的相关性Tab.3 Association of oxidative and inflammatory indexes with mitochondrial function-related proteins in SHR endothelial cells

2.4 氧化、炎症指标含量对粒体功能相关蛋白含量的影响

分别以高剂量组线粒体功能相关蛋白含量为因变量，以内皮细胞氧化、炎症指标含量为自变量，拟合回归方程显示，6项自变量(MDA、SOD、CAT、IL-1β、TNF-α、NO含量)对3项因变量(PINK1蛋白、Parkin蛋白、LC3蛋白)的综合影响均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

3 讨论

“病位在肝，根源在肾”是高血压核心中医病机，中医防治高血压讲究“整体条理，辩证施治”原则。复方七芍降压片因能改善SHR而导致的动脉内膜粗糙、管壁增厚，继而有效缓解炎症介质对血管内皮的损伤，最终有效逆转血管异常增生现状[10]。现有研究指出，哺乳动物体内的促炎、抗炎系统持续处于动态平衡中，其反应程度直接决定了血管损伤的修复效果，复方七芍降压片发挥降压效果的机制则可能与其减少炎症介质释放有关[11-12]。本研究旨在明确复方七芍降压片对内皮细胞增殖、内皮细胞线粒体自噬状况和炎症应激损伤的具体影响，特对50只SHR大鼠进行了对照实验研究。

表4 氧化、炎症指标含量和粒体功能相关蛋白含量的回归分析Tab.4 Regression analysis of the contents of oxidation, inflammation indexes, and mitochondrial function-related protein contents

研究数据显示，复方七芍各剂量组大鼠腹主动脉组织内皮细胞PINK1、Parkin、LC3蛋白含量均低于阳性对照组，明降压药物干预SHR大鼠能直接改善内皮功能，而厄贝沙坦、复方七芍降压片分别干预后后取得的短期效果亦有不同。结果还显示，复方七芍高剂量组大鼠PINK1、Parkin、LC3蛋白的检出水平均低于复方七芍低、中剂量组，说明在大鼠机体耐受的前提下，尽可能提高复方七芍降压片使用剂量能保持线粒体稳态，降低功能障碍程度[13]。线粒体作为真核细胞融合、分裂的平衡细胞器，其自噬程度直接影响着多种疾病发生或发展过程。具体分析复方七芍降压片作用机制，主要与其组方中不同药物组合搭配充分激活了血管重塑进程有关[14-15]。三七、白芍为君主要发挥活血化瘀通络功效；桑寄生、丹参、杜仲、天麻共为臣药，则主要发挥补益肝肾功效；萝芙木、葛根、地龙、炒香附共为佐药，则发挥平肝清热和息风通络的功效[16]，可见复方七芍降压片对SHR患者的调理作用不限定于心脑血管疾病，也有益于肝肾脏器的功能改善，但本研究尚未对SHR大鼠肝、肾指标进行检测，也有待后续研究加以完善。

研究还显示，复方七芍各剂量组大鼠腹主动脉组织内皮细胞MDA、IL-1β、TNF-α、NO含量均低于阳性对照组，同时复方七芍各剂量组大鼠腹主动脉组织内皮细胞SOD、CAT含量均高于阳性对照组，进一步说明氧化呼吸链中点子漏出情况有所减少，对应释放至胞浆中的活性氧、凋亡因子可能也有所降低，最终将有助于降低线粒体损伤程度[17]。但是该研究尚未对腹主动脉组织进行病理形态观测，不同复方七芍降压片使用剂量将对腹主动脉管壁厚度、中膜厚度、管腔内径造成何种长期影响，后续研究仍有待进一步探究。逐一分析各炎症或应激指标在不同剂量组SHR大鼠腹主动脉内皮细胞中的表达差异，高剂量组大鼠多效细胞因子IL-1β的低水平表达，则有益于抑制纤维细胞增殖或胶原合成，有效缓解病情进展[18-19]。而多效能促炎症因子TNF-α可直接引发血管内皮发生功能障碍，继而导致血管平滑肌持续增生肥大，因此常用于模拟高血压患者机体的炎症微环境，该指标的低水平表达则能降低炎症反应性疾病发生风险[20]。CAT含量差异则可能与复方七芍降压片通过降低P2Y6表达，继而抑制下游信号传递，并最终影响NFκB信号通路激活状况有关[21]。但与SHR关联的核内调控机制众多，复方七芍降压片抑制信号通路活动来发挥炎症抑制、应激抑制效果的具体通路仍需进一步探究。MDA、SOD检出含量在不同剂量复方七芍降压片干预SHR大鼠的体内亦有显著差别，可能与高水平复方七芍降压片发挥抗氧化屏障功效，并直接激活抗氧化系统，恢复体内氧自由基代谢平衡有关，也可能与其限制线粒体氧化磷酸化过程，从而恢复线粒体能量代谢失调有关[22]。同时，MDA和SOD含量改变也会影响线粒体膜脂质的过氧化进程，继而干扰神经毒性介质产生过程，最终影响炎症级联反应[23]。

相关性分析则发现，线粒体功能相关蛋白各项指标、氧化损伤和炎症损伤各项指标均呈现出显著关联性，这种关联效应不限于单一组别，对照组、阳性对照组、复方七芍各剂量组均有相同关联方向，确诊线粒体功能可直接或简介参与内皮细胞氧化损伤、炎症损伤过程。相关方向上，PINK1、Parkin、LC3蛋白与MDA、IL-1β、TNF-α、NO呈正相关，与SOD、CAT则呈负相关，该结果与上述讨论分析基本一致。总的来说，复方七芍降压片可有效维持细胞线粒体的自噬情况，保障细胞呼吸和能量转化正常运行，在稳定线粒体功能的基础上降低炎症、应激反应，并最终保护内皮细胞功能[24-25]。回归分析也发现，内皮细胞氧化、炎症指标含量对高剂量组SHR模型大鼠线粒体功能相关蛋白含量均有显著影响，拟合多项回归方程均有统计学意义，进一步证实内皮细胞的氧化、炎症过程会综合影响疾病大鼠线粒体相关功能。因此，通过内皮细胞功能相关指标的含量检测可一定程度上预测大鼠线粒体功能状态，但其实践效果仍需进一步扩大研究范围，加以验证。

综上所述，复方七芍降压片对内皮细胞的保护作用是通过多环节、多途径、多靶点加以实现的，总的来说，安全范围内加大复方七芍降压片使用剂量，将有助于维持SHR大鼠炎症、应激反应稳态。