以乙醇检测为例分析溶液温度对空气置换式移液器移液量的影响

刘国军，宋庆芳，夏 炎，蒋 萍，黄敏怡，梁国钜

(广东至信司法鉴定所，广东 东莞 523000)

空气置换式移液器(下文简称“移液器”)的工作原理为：移液器吸头接触液体液面使吸头和移液器内部形成封闭腔体，通过收缩活塞使腔体内形成负压，在负压的作用下将液体吸入腔体[1]。移液器的移液准确性受很多因素影响，罗志东发现使用不同规格的移液器吸头时移液量会有差异[2]，柯婷婷等人发现不同大气压环境下的移液量也会有差异[3]，费荣等人发现环境温度变化会对移液量产生影响[4]。本文作者在参照GA/T 842-2019《血液酒精含量的检验方法》[5](以下简称《GA/T 842》)使用内标-校准曲线法定量分析乙醇含量的实际工作中发现冰箱冷藏(4 ℃)和室温保存(24 ℃)两种温度下的叔丁醇内标工作液(下文简称“内标工作液”)用于顶空气相色谱分析时乙醇含量检测值会产生差异，进而研究了使用移液器移取不同温度的内标工作液时移取量的区别，并分析了润枪环节、溶液密度、溶液粘度对该差异的贡献。

1 实 验

1.1 实验材料

(1)乙醇空白添加样

蒸馏水中添加无水乙醇，制成浓度为80 mg/100 mL的乙醇空白添加样。无水乙醇(色谱纯)来源于永华化学科技(江苏)有限公司；蒸馏水，市售工业蒸馏水(一级)。

(2)叔丁醇内标工作液

蒸馏水中添加叔丁醇，制成浓度为4 mg/100 mL的内标工作溶液。叔丁醇(色谱纯) 来源于天津市科密欧化学试剂有限公司；蒸馏水，市售工业蒸馏水(一级)。

(3)器材与设备

移液器A，量程100～1000 μL，Transferpette公司；移液器B，量程20～200 μL，Genex Beta公司；上海佑科FA1004N电子天平(感量0.1 mg)；岛津Nexis GC-2030气相色谱仪，搭载HS-20NX自动顶空进样器。

(4)统计学分析使用SPSS软件，来自IBM公司。

1.2 研究方法

1.2.1 不同温度叔丁醇内标工作液检测乙醇含量

将内标工作液分别置于两种温度下保存，A组置于4 ℃冰箱冷藏，B组置于室温放置。参照《GA/T 842》的前处理方法，分别移取两组溶液各7份，每份0.50 mL，置于顶空瓶内，每份加入0.10 mL乙醇空白添加样(80 mg/100 mL)，加盖密封，轻缓摇匀后，放入自动顶空进样器进样检测。使用移液器移取溶液时，均按日常工作习惯使用所移取的溶液润洗3次移液器吸头。

1.2.2 移液器在不同情况下移取溶液的质量测定

按照表1中分组，分别用不同的润枪方式移取不同温度的内标工作液0.50 mL加入烧杯，使用电子天平准确称量每份工作液的质量。

表1 称量分组情况

1.2.3 统计分析

使用SPSS软件对各试验组结果分别进行独立样本T检验，判断不同温度的内标工作液用于乙醇检测时检测值是否存在差异，以及分析移液器在不同情况下移取不同温度的内标工作液的移取量是否存在差异。

2 结果与讨论

(1)按照1.2.1分A组(低温内标组)和B组(室温内标组)分别进行前处理、GC检测乙醇空白添加样，检测结果见表2。

表2 A组、B组测定乙醇空白添加样结果

比较A组和B组的结果，经统计分析，低温内标工作液和室温内标工作液用于乙醇检测时的检测结果差异有统计学意义(p<0.01，平均差值为3.1 mg/100 mL，Cohen’s d值为4.785)，A组和B组试验过程中添加乙醇空白添加样的操作并无差别，理论上乙醇含量并无区别，因此推测两组乙醇检测值的差异来源于移液器移取不同温度内标工作液时移取量的不同。

(2)用不同的润枪方式移取不同温度内标工作液0.50 mL，称量结果见表3，对比不同实验组的差别，分析差异产生的环节。

表3 用不同的润枪方式移取不同温度叔丁醇工作液称量结果

①比较C组和D组的结果，经统计分析，差异有统计学意义(p<0.01，平均差值为0.012 g，Cohen’s d值为8.618)，证实了2.1中A、B两组试验的结果差异来源于移取内标工作液的量的差别。

②比较C组和E组，差异有统计学意义(p<0.01，平均差值为0.015 g，Cohen’s d值为24.908)，且D组和F组的差异也有统计学意义(p<0.01，平均差值为0.016 g，Cohen’s d值为32.444)，说明用不同温度的溶液润枪会导致移液器移取的液体量产生差异。低温气体的密度通常更大，在1个标准大气压下，标准温度为280 K的空气密度约为1.245 kg/m3，300 K的空气密度约为1.161 kg/m3[6]，用低温溶液润洗移液器吸头后，可能会导致移液器吸头和腔体内的空气在短时间内温度降低、密度增大、气体总量增大，从而导致移液器移取液体时产生的吸力减小、移取液体的量减少。

③比较C组和F组的结果，差异有统计学意义(p<0.01，平均差值为0.004 g，Cohen’s d值为5.712)，且D组和E组的差异也有统计学意义(p<0.01，平均差值为0.003 g，Cohen’s d值为7.729)。C组和F组、D组和E组的润枪过程相同，而相同的润枪过程可大幅降低溶液粘度(运动粘性系数)对移取量差异的的贡献，因此推测除润枪环节、溶液粘度的影响外，不同温度内标工作液本身的密度也会导致移取量产生差异。低温液体的密度通常更大，标准温度为280 K的水密度约为999.91 kg/m3，标准温度为300 K的水密度约为996.56 kg/m3[7]，因此，在润枪环节相同的条件下，移液器移取低温溶液的量要稍大于室温溶液。

C组、F组以及D组、E组的平均差值和Cohen’s d值远小于2.2.2中润枪环节的对应值，可以推断溶液密度差异对于溶液移取量总体差异的贡献要远小于润枪环节，其原因为温度变化对于气体密度的改变程度要远大于对液体密度的改变程度。

④比较D组和H组的结果，差异有统计学意义(平均差值为0.001 g，Cohen’s d值为3.417)。用室温溶液润洗移液器吸头理论上不会改变移液器吸头和腔体内空气的温度，因此，在比较D组和H组的差异时，可以忽略移液器吸头和腔体内空气温度的改变，且溶液密度相同，则此时该两组的结果差异主要来源于溶液粘度。由于在研究液体粘度的同时很难排除液体密度的干扰，故本文未对低温溶液和高温溶液粘性差异对移取液体量的影响作更深入的研究。

D组、H组平均差值和Cohen’s d值小于2.2.3中溶液密度因素，可以推断溶液粘度对于溶液移取量总体差异的贡献要小于溶液密度。

⑤G组和H组并没有润枪环节，其差异来源于溶液密度和粘度两方面，比较G组、H组的平均差值(0.005 g)和Cohen’s d值(14.616)和C组、E组(平均差值为0.015 g，Cohen’s d值为24.908)以及D组、F组(平均差值为0.016 g，Cohen’s d值为32.444)，发现G组、H组的差异远小于后者，可以推断溶液密度和粘度差异对于溶液移取量总体差异的贡献之和也要远小于润枪环节，其原因也是温度对于气体密度的改变程度要远大于对液体密度、粘度的改变程度。

3 结 论

在乙醇含量检测(顶空气相色谱仪、内标-校准曲线法)工作中，使用不同温度的内标工作液会导致检测结果产生差异，在同等操作方法的前提下，使用低温内标溶液的乙醇检测值要高于使用室温内标溶液时。该现象的原因为使用空气置换式移液器移取不同温度内标溶液时移取量会产生差异，该差异可能来源于3个因素，按照贡献程度由高到低依次是：润枪环节中低温内标工作液对移液器吸头和腔体内空气密度的改变从而导致移取液体时产生的吸力减小、低温内标工作液本身的密度、低温内标工作液本身的粘度。

在使用空气置换式移液器移取密度、粘度与叔丁醇溶液相似的其他溶液进行定量分析时，上述结论亦有参考意义。因此，在使用空气置换式移液器进行内标-校准曲线法定量分析时，应注意待测样品前处理过程中所使用的工作液温度与校准曲线的前处理保持一致。