秋水仙素诱导万寿菊多倍体种质创制研究

陈建新，张春来，张海楠，吕晋慧

(1.山西农业大学林学院，山西 晋中 030801；2.山西农业大学农学院，山西 晋中 030801)

万寿菊(TageteserectaL.)为菊科一年生草本植物，具有重要的医药价值和观赏价值，根据使用功能可分为观赏万寿菊和色素万寿菊。其中，色素万寿菊花富含叶黄素，可用于制造食品饲料添加剂、化妆品[1-2]，色素万寿菊也被用于治疗心血管、肾脏等疾病[3]。观赏万寿菊在提供观赏的同时还能富集重金属[4]。

我国用于生产色素的万寿菊种植面积超过20 000 hm2，占全世界的85%以上，然而这远远不能满足市场需求。主要原因是色素万寿菊单位面积产量低、色素含量低、抗逆性差，因此亟需进行色素万寿菊育种研究。万寿菊原产墨西哥，我国缺少性状优良的种质资源，阻碍了传统杂交育种的研究进展。秋水仙素诱导多倍体育种周期短、效果好，已在农作物、花卉、中药材等多种植物中获得成功[5,7]。多倍体植株多表现出抗逆性强，代谢物质含量高，营养价值高等特性[8-9]。目前万寿菊育种主要集中在杂交育种方面，多倍体育种相关报道较少。本研究通过秋水仙素诱导染色体加倍，为万寿菊育种创制和研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

万寿菊种子为赤峰赛诺园艺有限公司生产的万寿菊F1(SN 201)。秋水仙素、番红、固绿等主要试剂均从索莱宝公司购买。

1.2 试验方法

1.2.1万寿菊多倍体诱导

万寿菊子叶期(苗龄10 d)采用秋水仙素滴液法处理茎尖，秋水仙素浓度为0.25%、0.20%、0.15%、0.10%、0.05%，蒸馏水处理(0%)为对照，共6个处理，每处理100盆。每天18：00时处理1次，连续处理2 d，滴液处理后用透明塑料杯扣苗，防止蒸发，第3天18:00时用蒸馏水洗净。

秋水仙素处理结束2个星期后统计死亡率，完全失去绿色的植株记为死亡株。秋水仙素处理结束2个月后统计变异植株，单株80%以上的叶片有叶色变化、叶片增厚、叶片弯曲、叶片增大、叶缘变化现象则判定为形态变异株，统计形态变异率[10]。

死亡率(%)=(死亡植株数/处理植株数)×100%；

形态变异率(%)=(形态变异植株数/处理植株数)×100%。

1.2.2多倍体鉴定

取疑似多倍体植株中上部叶片，用湿滤纸包裹，放入自封袋，存于冰盒寄送北京金迪未来生物科技有限公司进行流式细胞仪(德国Partec公司，Partec CyFlow Space)检测。参照李懋学和张方[11]的压片法对流式细胞仪鉴定的多倍体植株进行染色体鉴定。

1.2.3多倍体植株特性

用卷尺测量冠幅、株高，游标卡尺(得力集团有限公司，DL 91150)测量地径，叶面积测量仪(山东方科仪器有限公司，YMJ-G)测量叶面积、叶长、叶宽。

撕胶带法制片[12]，在Olympus CX 31-32 C 02光学显微镜下统计单个视野内气孔数量，保卫细胞内叶绿体数目，每个类型随机观察30个视野，计算平均值。使用明美显微数码测量分析系统(广州市明美光电技术有限公司，V 1.5.2)拍照，测量保卫细胞长度和宽度，采用石蜡切片法观察叶片横截面变化[13]。

紧实度=栅栏组织厚度/叶片厚度；

疏松度=海绵组织厚度/叶片厚度。

参考符芳宁[14]的方法测定比叶鲜重、比叶干重、叶片含水率(LWC)。光合色素采用丙酮法测定[15]，可溶性糖(SS)采用蒽酮比色法，可溶性蛋白(SPC)测定采用考马斯亮蓝-G 250法，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法[16]。

1.3 数据分析

采用SPSS 13.0软件进行方差分析，采用Duncan法进行多重比较，极显著水平为0.01，标注大写字母，显著水平为0.05，标注小写字母，用Microsoft Excel软件进行数据整理计算，Sigma Plot软件绘图，所得结果用平均值±标准差(SD)表示。

2 结果与分析

2.1 万寿菊多倍体诱导

2.1.1秋水仙素对万寿菊生长的影响

随秋水仙素浓度增加万寿菊株高和冠幅呈降低趋势。秋水仙素处理下株高和冠幅极显著小于对照(p<0.01)，0.05%与0.10%处理下万寿菊株高与冠幅极显著高于0.25%、0.20%、0.15%处理，0.05%与0.10%处理之间株高、冠幅无显著差异，0.25%、0.20%和0.15%处理之间株高、冠幅无显著差异(图1)。秋水仙素抑制万寿菊生长，对照的生长速度大于秋水仙素处理下的生长速度(图1)。对照植株每周的株高增长量大于3.72 cm，秋水仙素处理下植株每周的株高生长量小于0.49 cm；28 d内对照植株的株高生长量为24.91 cm，秋水仙素处理下株高总生长量小于0.91 cm。

2.1.2秋水仙素对万寿菊的诱导效果

随秋水仙素浓度增加，死亡率呈升高趋势(表1)。秋水仙素处理下万寿菊死亡率显著高于对照，其中0.25%处理死亡率最高，为56.00%，0.10%处理死亡率最低，为18.50%。各处理间死亡率差异显著。

图1 秋水仙素对万寿菊生长的影响Fig.1 Effect of colchicine on the growth of Tagetes erecta L.

表1 秋水仙素对万寿菊的诱导效果Table 1 Induction effect of colchicine on Tagetes erecta L.

秋水仙素处理下万寿菊形态变异率显著增加，其中0.10%处理下形态变异率最高，显著高于其他处理，0.25%处理下形态变异率显著低于其他秋水仙素处理。

2.1.3秋水仙素对叶片形态的影响

秋水仙素对万寿菊叶片变异有明显影响，其中0.05%处理下有叶片增大、叶片增厚、叶色变深、锯齿变细、裂片宽度增加5种变异类型，其他秋水仙素处理下变异类型均为4种，0.10%处理下叶片变异类型为叶片增大、叶片增厚、叶色变深和叶面皱缩，0.15%、0.20%和0.25%处理下叶片变异类型为叶片增大、叶片增厚、叶色变深和锯齿变化(图2)。

各秋水仙素处理下均是叶片增大变异率最高，且随秋水仙素浓度增加叶片增大变异率呈先增加后降低趋势，叶片增大变异率依次为0.10%>0.15%>0.05%>0.20%>0.25%，0.10%处理下变异率为68.29%，0.25%处理下变异率为18.42%。叶片增厚在0.05%处理下变异率最高，为14.81%，其次是0.25%处理，为13.04%，其余处理下变异率不足10%。锯齿变异类型在0.15%处理下变异率最高，为13.33%，0.10%处理下没有明显变异，其余处理下变异率不足10%。裂片宽度增加变异类型仅出现在0.05%处理，叶面皱缩变异类型仅出现在0.10%处理(表2)。

表2 秋水仙素对叶片形态的影响Table 2 Effects of colchicine on leaf morphology

2.2 万寿菊倍性鉴定

2.2.1流式细胞仪鉴定

在盛花期对疑似多倍体进行流式细胞仪鉴定，从叶片细胞DNA含量分布图可以(图3)看出，对照的荧光强度在200处出现1个峰值，而其他处理在400处出现1个荧光强度峰值的植株确定为四倍体，在200、400处出现2个荧光强度峰值的变异植株为嵌合体。对万寿菊基因组大小进行检测，二倍体和四倍体基因组大小分别为823.57 M、1 576.73 M，四倍体基因组大小是二倍体的1.92倍。

2.2.2染色体鉴定

对流式细胞仪鉴定出的四倍体植株进行染色体鉴定，二倍体根尖细胞内染色体数目2 n=2 x=24，四倍体植株细胞体积增大，染色体数目2 n=4 x=48(图4)。

注：1为对照；2为锯齿变异；3为叶片增大叶色变深；4为叶片增厚；5为裂片宽度增加；6为叶面皱缩。图2 变异植株叶片特征Fig.2 Leaf characteristics of variation plants

注：1为对照；2为四倍体；3为嵌合体图3 流式细胞仪检测DNA含量分析Fig.3 Analysis of DNA content detected by flow cytometry

2.3 多倍体特性分析

2.3.1形态特征

万寿菊四倍体与二倍体在形态特征上有显著差异(p<0.05)。四倍体株高、冠幅、节间分别比二倍体低21.45%、41.12%、19.60%。万寿菊叶片和花有一定的观赏价值，四倍体叶面积、叶片长度、叶片宽度分别是二倍体的1.90倍、1.56倍、1.43倍，腺点密度比二倍体降低48.42%。四倍体的舌状花瓣长度与宽度分别增加20.61%、9.42%，花梗长度缩短45.81%，提高了花的观赏性(图5)。四倍体的地径和叶型指数与对照无显著差异(表3)。

2.3.2细胞学特性

万寿菊四倍体与二倍体在气孔密度、保卫细胞长度、保卫细胞宽度、保卫细胞长宽比、保卫细胞内叶绿体数量方面有显著差异(p<0.05)。四倍体植株气孔密度降低57.53%，保卫细胞长度、保卫细胞宽度、保卫细胞长宽比、保卫细胞内叶绿体数量分别是对照的2.06倍、1.80倍、1.12倍、1.42倍(表4，图6)。

2.3.3叶片解剖结构分析

万寿菊叶片为典型的异面叶，近轴面为栅栏组织，远轴面为海绵组织，叶片结构由外向内包括表皮、叶肉、叶脉(图7)。万寿菊四倍体与二倍体在叶片厚度及各结构组织厚度上有极显著差异(p<0.01)。四倍体万寿菊叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、上下表皮细胞厚度分别是二倍体的1.72倍、1.68倍、1.92倍、1.63倍、1.60倍，说明叶片厚度增加主要是由栅栏组织、海绵组织、上下表皮细胞等部位厚度增加引起。四倍体万寿菊的栅海比显著降低12.71%，疏松度极显著提高10.81%。四倍体万寿菊的紧实度与对照差异不显著(表5)。

注：1为二倍体(2 n=2 x=24)；2为四倍体(2 n=4 x=48)。图4 万寿菊染色体数目Fig.4 Numbers of Tagete erecta L. chromosomes

注：1为四倍体；2为二倍体。图5 万寿菊花Fig.5 Flower of Tagetes erecta L.

注：1为二倍体；2为四倍体。放大倍数为20×40倍。图6 万寿菊叶片气孔Fig.6 Stomata on Tagetes erecta L. leaves

注：1为四倍体；2为二倍体。放大倍数为20×10倍。图7 万寿菊叶片横切Fig.7 Tagetes erecta L. leaves cross cut

表3 四倍体叶片与花的形态特征Table 3 Morphological characteristics of tetraploid leaves and flowers

表4 四倍体叶片气孔观察Table 4 Stomata observation of tetraploid leaves and flowers

表5 四倍体叶片解剖结构Table 5 Anatomical structure of tetraploid leaves

2.3.4四倍体生理生化测定

万寿菊四倍体与二倍体在叶片鲜重和干重方面差异极显著(p<0.01)。四倍体万寿菊叶片鲜重增加36.18%，干重增加21.95%，叶片含水率与二倍体无显著差异(表6)。

表6 四倍体叶片含水率Table 6 Water content in tetraploid leaves

万寿菊染色体加倍后叶片中的叶绿素含量和类胡萝卜素含量极显著降低(p<0.01)。四倍体万寿菊叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量和类胡萝卜素含量分别比二倍体降低46.51%、42.00%、45.28%、51.92%。叶绿素a/b值大于3，属于典型的阳性植物，万寿菊二倍体与四倍体的叶绿素a/b值分别为4.28、3.92，四倍体叶绿素a/b值极显著降低(表7)。

四倍体万寿菊的可溶性糖、丙二醛及可溶性蛋白含量与对照相比无显著变化(p>0.05)(表7)。

表7 四倍体叶片中物质含量Table 7 Substance content in tetraploid leaves

3 讨论与结论

多倍体诱变是基因组突变，可产生更大变异表型[17]。张静静[18]用秋水仙素诱导铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)时，除叶片增厚、叶色加深外，还出现了植株矮化、丛生，叶片变脆、易折断等变异类型。万寿菊用秋水仙素处理后出现叶片增大、叶片增厚、花增大，同时还有叶色变异、锯齿变异、株高降低等表型，经鉴定，多倍体诱导后并不是所有性状均呈增大趋势。

秋水仙素的诱导效果与处理浓度、作用时间、环境温度和植物材料等因素有很大关系[19]。童俊[20]用0.50%～0.80%的秋水仙素处理紫薇48 h，形态变异率较高，周玉丽[21]用0.20%秋水仙素处理连翘72 h形态变异率较高，本试验用0.10%～0.15%的秋水仙素处理万寿菊48 h形态变异率较高，不同植物间秋水仙素的使用浓度和时间差异较大，可能是不同植物的抗性不同，也可能是环境影响较大。

万寿菊在0.25%秋水仙素处理下形态变异率低于50%，死亡率高于50%，死亡率较高形态变异率较低；0.05%处理下植株死亡率低于30%，形态变异率大于60%，死亡率较低，没有出现加倍植株。如何平衡浓度与变异率之间的关系是诱导的关键，0.10%与0.15%两个处理下形态变异率较高，为秋水仙素诱导万寿菊的最佳使用浓度。

秋水仙素处理后万寿菊生长发育受到不同程度抑制，一部分幼苗虽然成活但是停止生长，一部分幼苗死亡，可能是有丝分裂异常，打破了幼苗体内生理代谢平衡。秋水仙素处理下万寿菊生长过程中出现萎蔫情况，与高静[22]的研究结果类似，这可能是秋水仙素对植物存在毒害作用。

万寿菊染色体加倍后株高和冠幅降低，地径增粗，在一定程度上增强了植株抗性。万寿菊花瓣的长度与宽度增加，提高了观赏价值；腺点密度降低，在一定程度上减少异味散发，从而提高园林使用价值，减少工作人员操作的不适性。

不同植物多倍体的性状变化趋势存在差异，四倍体万寿菊株高降低、叶片增大增厚；四倍体云锦杜鹃(RhododendronfortuneiLindl.)叶片减小、变圆[23]，四倍体穗花牡荆(Vitexagnus-castusLinn.)株高增加、叶片增大[24]。Van Laere K等[25]认为，不同品种间多倍体的性状变化趋势也不一致，弯穗苞叶芋(SpathiphyllumwallisiiRegel.)诱变植株中，四倍体MS 8花柄缩短，6 341和6 526这2个品种花柄长度增加。

多倍体植株一般代谢旺盛，细胞内代谢物质含量高，万寿菊四倍体与二倍体在丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白含量方面差异不显著，可能是万寿菊没有处在胁迫条件下，相关基因未表达。四倍体万寿菊的叶片比叶干重与比叶鲜重显著增加，但是叶片含水率没有增加，说明万寿菊加倍后某些物质可能发生变化。

叶片特征变化反映植物适应能力强弱。多倍体植株叶片增大，受光面积增加；栅栏组织厚度增加，有利于叶绿体排列方向改变；海绵组织厚度增加，可减少光量子的透射损失，同时促进叶片内部气体交换速率，提高叶片光能利用率[26]。四倍体万寿菊栅海比显著降低，对高温的抗逆性增强；叶片上表皮细胞增厚，对叶绿体光合结构保护性增强[27]，此外四倍体万寿菊叶片中叶绿素a/b值降低，耐阴性增加，可与其他高大植物间作，减缓万寿菊连作障碍。