蓝影试剂在法医血痕DNA检验中的适用性

严安心，凃 政，赵禾苗，彭 柱，徐 珍

(公安部鉴定中心，法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038）

蓝影试剂（Blueblood reagent），也称为蓝影血液追踪试剂，是一种新型的潜血痕显现剂，能够使潜血痕呈现蓝色。与法医物证鉴定常用的四甲基联苯胺、鲁米诺等[1]潜血痕发现试剂相比，蓝影试剂比四甲基联苯胺显色更迅速、颜色更清亮、背景更清晰、无扩散[2]；其与鲁米诺相比，显现过程不需要暗视场，且一旦着色，能持久显现，便于观察和记录[3]。目前，蓝影试剂已应用于公安现场勘查[2]。多数情况下，现场发现的潜血痕需进行后续DNA检验，但当前还罕有蓝影试剂对DNA检验影响的研究报道。本文从显色特异性、灵敏度以及对人血红蛋白（如FOB（fecal occult blood），即便潜血）金标试剂条检测、对DNA分型检验的影响等方面就蓝影试剂相关于DNA检验的应用性进行综合评估。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

人样本：血、精液、尿液、唾液样本由志愿者提供，其中血样本1份（3 mL）；精液、尿液样本各1份，均为1 mL；唾液样本6份（来自6名志愿者），0.5 mL/份。

非人样本：马、羊、牛、鸭、鹅、鸡、猫、狗、兔等动物血各1份，委托兽医在动物日常防疫时帮助采集；大、小鼠血各1份，由公安部鉴定中心实验动物房提供；鱼血1份，由实验人员在农贸市场收集；上述所有血样均制作成滤纸片干血斑。葡萄、橙子、凉茶、可乐、醋、酱油、豆油、番茄、洗洁精、84消毒液等购自超市；日用剪刀和拖把杆（均有锈蚀）。

蓝影试剂：北京海洋海泰科技有限公司产品，每套蓝影试剂由试剂A和试剂B组成，试剂A为含有显色底物与保护剂（避免非血痕类斑迹与蓝影试剂发生蓝色反应）的水溶液，试剂B为3%双氧水溶液，将A、B试剂充分混匀即形成实验用的蓝影试剂[4]。

人血红蛋白（FOB）检测试剂条（北京芬格尔安科技有限责任公司）；VeriFilerTMPlus试剂盒（ThermoFisher Scientif ic）；自动化核酸提取工作站（长春市博坤生物科技有限公司）；ProFlexTM3×32-well PCR扩增仪、3500xL遗传分析仪（ThermoFisher Scientif ic）。

1.2 显色特异性测试

1.2.1 样本的制备

血痕样本的制备：取10 μL人血滴在干净的滤纸上，晾干备用；剪取适量含有动物血样的滤纸片，加100 μL纯水振荡浸泡30 min，取10 μL浸泡液滴在干净的滤纸上，晾干备用。

非血迹样本的制备：取精液、尿液、唾液1（牙龈无出血情况）、唾液2（牙龈有潜在出血情况）、葡萄汁、橙汁、凉茶、可乐、醋、酱油、豆油、番茄汁、洗洁精、84消毒液各10 μL滴在干净的滤纸上，晾干备用。

生锈物品的准备：生锈的剪刀和拖把杆。

1.2.2 试验方法

每个制备样本上均分别滴加40 μL蓝影试剂、在生锈物品表面喷洒蓝影试剂，观察显色情况。

1.3 显色灵敏度测试

取健康成年人血液，稀释成下列梯度：原液、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000，分别取10 μL滴于滤纸上，自然晾干，制成血斑。同1.2.2试验与观察颜色显现。

1.4 显色反应对人血红蛋白确证实验的影响

取血液原液、1∶100、1∶200的血液稀释液各10 μL滴于滤纸上，自然晾干，制成血斑。在每个血斑上分别滴加40 μL蓝影试剂，显色15 min以上使显色反应完全。以不加蓝影试剂的血斑为对照组。将血斑剪下置于1.5 mL离心管内，加入300 μL纯水浸泡，进行FOB试剂条检验，观察检验结果。

1.5 DNA分型检测

在滤纸上滴加60滴志愿者血样（每滴1 μL），制成60个干血斑，其中30个血斑喷洒蓝影试剂，作为实验样本；另外30个血斑不喷洒蓝影试剂，作为对照样本。采用磁珠法、Chelex-100法、样本直扩法制备PCR扩增模板。使用VeriFilerTMPlus试剂盒对DNA溶液或直扩样本进行PCR扩增，反应体系总体积10 μL，扩增程序与设置参照说明书。应用AB3500xL遗传分析仪检测、分析样本的DNA分型。

磁珠法提取DNA：采用自动化核酸提取工作站提取实验与对照样本各10个的DNA，其中洗脱体积为60 μL。PCR扩增所用模板量为1 μL。

Chelex-100法提取DNA：采用Chelex-100法提取实验与对照样本各10个的DNA，其中5% Chelex的用量为100 μL。PCR扩增所用模板量为4 μL。

样本直扩法：选择实验与对照样本各10个作为直扩样本。PCR扩增时使用打孔器在血斑中心打孔作为模板。

2 结果

2.1 显色特异性测试

蓝影试剂不仅可显现人血，而且能显现马、羊、牛、鸭、鹅、鸡、大鼠、小鼠、鱼、猫、狗、兔等动物血，各种血斑均显现蓝色（见图1），可见蓝影试剂不能区分人血和动物血。

图1 蓝影试剂对各种血迹的显色情况（1：人；2：马；3：羊；4：牛；5：鸭；6：鹅；7：鸡；8：大鼠；9：小鼠；10：鱼；11：猫；12：狗；13：兔）Fig.1 Origin-various bloodstains (1: human; 2: horse; 3: sheep; 4: ox; 5: duck; 6: goose; 7: chicken; 8: rat; 9: mouse; 10: f ish; 11: cat; 12:dog; 13: rabbit) developed by Blueblood reagent

由图2可知，对于犯罪现场可能遇到的精液、尿液、葡萄汁、橙汁、凉茶、可乐、醋、酱油、豆油、番茄汁、洗洁精等非血痕类斑迹，滴加蓝影后均不显现蓝色；但对于唾液，若唾液所属个体无牙龈出血情况，则蓝影不会使其显现蓝色，若唾液所属个体有牙龈出血情况（即便眼睛观察不到血丝，但FOB试剂条检测阳性），则滴加蓝影后显现浅蓝色；蓝影试剂能与84消毒液反应生成明亮的蓝色物质。在生锈物品上喷洒蓝影试剂后，未观察到显色反应（见图3）。

图2 蓝影试剂对不同斑迹的显色情况（1：精液；2：尿液；3/4：唾液1/2（牙龈无/有出血情况）；5：葡萄汁；6：橙汁；7：凉茶；8：可乐；9：醋；10：酱油；11：豆油；12：番茄汁；13：洗洁精；14：84消毒液）Fig.2 Effect of color developing with Blueblood reagent sprayed onto different stains (1: semen; 2: urine; 3/4: saliva 1/2 from the donor suffering without/with gum hemorrhage; 5: grape juice; 6: orange juice; 7: cooled tea water; 8: coke juice; 9: vineger; 10: sauce; 11: bean oil;12: tomato juice; 13: detergent; 14: 84 disinfectant)

图3 喷洒蓝影试剂于生锈物体表面上的显色情况（左：生锈的剪刀；中/右：生锈的拖把杆。箭头指示铁锈位置）Fig.3 Effect of color developing with Blueblood reagent sprayed onto the surface of rusted objects (left: scissors; middle/right: mop rod.Arrows indicate the rusting places)

2.2 显色灵敏度测试

蓝影试剂滴加到不同稀释度的血斑上后，原液及1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000的 稀释液能够在数秒内显现蓝色，继续放置，在5 min内1∶2 000、 1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000的稀释液也能呈现出浅蓝色，但未观察到1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000的稀释液的显色情况（图4）。随着血液浓度的降低，显色深度逐渐变浅。

图4 不同稀释梯度血样的显色情况（着色时间5min）Fig.4 Effect of dilution-various blood samples on color developing with Blueblood reagent (color appearing within 5 minutes)

2.3 显色反应对FOB确证实验的影响

血液原液、1∶100和1∶200血液稀释液经蓝影试剂着色后，立即进行FOB试剂条检验，均可观察到阳性结果；显色15 min后（使显色反应更加充分）再进行FOB试剂条检验，血液原液、1∶100血液稀释液可检测到阳性，但1∶100血液稀释液的阳性与对照组相比明显较弱，1∶200血液稀释液的检测结果为阴性。

实验表明，血迹经蓝影试剂着色后，与抗人血红蛋白抗体的反应会受到抑制，可能出现FOB试剂条检验假阴性的情况（如图5）。

图5 蓝影着色15min后血迹的人血红蛋白检测Fig.5 Inf luence of Blueblood reagent dyeing (for 15 minutes) on detecting human hemoglobin from bloodstains

2.4 DNA分型检测

实验样本喷洒蓝影试剂后，均呈现深蓝色。Chelex-100法、样本直扩法与对照组相比，蓝影着色血痕的DNA分型检出率（用完整分型检出率表示，下同）和平均峰高均明显降低，表明蓝影试剂对PCR扩增有一定的抑制作用。磁珠法显示，洗脱后的蓝影着色血痕的DNA溶液呈无色透明状，实验组和对照组的所有样本均获得了完整、正确的分型且两组的平均峰高无明显差异，表明磁珠法可有效去除蓝影试剂中的PCR抑制成分。表1显示三种DNA提取方法对蓝影试剂着色血痕影响的具体情况。

表1 不同DNA提取方法对蓝影着色血迹DNA分型检验的影响Table 1 Effects of different DNA extra ctions on DNA genotyping from bloodstains developed with Blueblood reagent

3 讨论

蓝影试剂是一种无刺激气味、浅黄绿色澄清水溶液，其与血痕发生显色反应的基本原理是血痕中的血红蛋白具有类似过氧化物酶活性，能将过氧化氢分解，释放出新生态氧，将试剂中的显色底物氧化成蓝色[4]。蓝影试剂能使人血和各种动物血显现蓝色，但对精液、尿液、葡萄汁、橙汁、凉茶、可乐、醋、酱油、豆油、番茄汁、洗洁精等斑迹均不会显现蓝色，表明蓝影试剂具有一定的血迹显现特异性。

本文针对6个志愿者的唾液斑进行蓝影显现测试，有4个唾液斑不显色、2个唾液斑显蓝色，随后对6个唾液斑进行人血红蛋白检测，发现前4个唾液斑呈阴性、后2个唾液斑阳性，表明经蓝影试剂检测呈阳性的原因是相关唾液中含有潜血。铁锈能使四甲基联苯胺、鲁米诺的血痕预实验产生假阳性[5]，而笔者所用的蓝影试剂中由于加入了抑制铁锈反应的保护剂[4]，所以铁锈不会使蓝影试剂的血痕预实验产生假阳性。

值得注意的是，蓝影试剂与84消毒液会产生明亮的蓝色反应，故在现勘应用中要观察现场是否有84消毒液存在，若有，则要慎重使用蓝影试剂。宋华杰等[2]的研究中，牛奶、鸡蛋清会引起蓝影试剂的假阳性反应，但笔者对牛奶和鸡蛋清的多次检验均未发现假阳性反应，对比实验过程，可能是使用的蓝影试剂产自不同厂家所致，经咨询生产厂家，笔者使用的蓝影试剂中的保护剂经多次改良，能抑制多种非血迹类物质的假阳性反应。犯罪现场的斑迹种类繁多，本文在此讨论的斑迹种类还十分有限，针对蓝影试剂显现特异性的研究还有待在今后的工作中进一步完善。

蓝影试剂能够显现稀释倍数为10 000的血液稀释样本，表明其可用于痕量血迹的检测。值得注意的是，当血痕稀释倍数为2 000～10 000时，其显现所需时间略长（但在5 min以内）且蓝色较弱，这就提示在用蓝影搜索极微量或陈旧血痕时应当延长显色时间，或可喷洒5 min后观察，此时再喷洒少许并直接进行观察，显现效果会更佳。在搜索深色或蓝色物体上极微量血痕时，蓝影试剂的显现受背景影响较大，不易观察，此时可以考虑使用红外光源或鲁米诺进行血痕搜索[6-8]。蓝影试剂对血迹染色后，会影响血红蛋白与其抗体的反应，因此微量血痕经蓝影试剂显色后再进行人血红蛋白检验，甚至会出现假阴性检测结果。

蓝影试剂中存在一定量的PCR抑制成分，磁珠法DNA提取过程可有效去除这些成分，蓝影着色血迹经磁珠法提取DNA后的分型检出率要高于Chelex-100法和样本直扩法，因此，针对蓝影着色后的血迹，建议采用磁珠法进行DNA提取纯化。

本文综合分析了蓝影试剂的血痕显色特性和对后续DNA分型的影响，应可为该试剂在DNA检验中的应用提供一定的技术参考。