1日龄雏鸡胎粪禽白血病检测流程的建立*

陈小娇，张妹，康翠翠，陈文平

（1.北京市华都峪口禽业有限责任公司，北京 101206；2.国家蛋鸡产业技术体系平谷综合试验站，北京 101206）

禽白血病（Avian Leukosis，AL）是可垂直传播的病毒性肿瘤病，呈世界性分布，严重制约着养禽业的发展。由于该病的防治无有效药物和疫苗，唯一有效的控制方法就是对核心鸡群进行净化。近几年，大多数养禽场已开展核心鸡群禽白血病的研究与净化工作，而1日龄雏鸡胎粪禽白血病P27检测是建立阴性鸡群的第一步，对禽白血病净化起到关键作用。

1 准备胎粪样品稀释液

不同厂家的禽白血病P27试剂盒的检测要求不同，根据说明书使用对应的胎粪样品稀释液。同时在出鸡前需准备足够的样品稀释液，根据种蛋入孵数量和所入选品系的种蛋受精率、孵化率来计算出雏数量。如果种蛋入孵10 000枚，假设受精率、孵化率分别为90%、80%，那么出雏数量是：10 000×90%×80%=7200（只）。那么需要准备胎粪样品稀释液7200份，每个离心管中加入0.5 mL样品稀释液[1]。

2 采集胎粪样品

雏鸡鉴别人员负责胎粪样品的采集工作，对出雏纸袋中刚出壳的每只雏鸡进行翻肛性别鉴别，逐只采集雏鸡胎粪，挤到加有0.5 mL稀释液的2 mL离心管中，在离心管盖上用马克笔标记家系号[2]，将采集完的胎粪样品置于常温放置。胎粪样品采集前，鉴别人员的双手应进行彻底消毒，在完成一个家系鸡只胎粪采集后双手还要再次消毒，避免不同家系间感染；若采集过程中手指沾到大量胎粪时，应及时进行消毒，避免引起相同家系间鸡只的交叉感染。从采样环节严格控制不同家系间或同一家系鸡只的交叉感染，能够有效保障检测结果的准确性。

3 胎粪样品冻融

3.1 胎粪样品混匀

将采有胎粪样品的离心管上下左右摇晃、震荡，直至胎粪块与稀释液完全融合；为防止离心管掉到液氮罐中，避免出现漏检，需将摇匀的样品放到纱布袋里，收紧口袋，置于液氮罐中保存。

3.2 胎粪样品冻融

将胎粪样品按不同品系分类放到不同的液氮罐里，冷冻5 min。之后取样人员双手一定要带上棉线手套，用大镊子夹取长绳，慢慢往上拉出样品，将取出的胎粪样品在空气中停留至无液氮挥发后，方可放到桌面。放置时，注意离其他人员远一点。

3.3 胎粪样品回温

待胎粪样品在空气中放置10 min后，将样品按着标注的品系、家系的顺序码放于冻存盒内。将码放好的样品放置38 ℃恒温箱中回温直至样品完全解冻，一般样品回温1.5 h即可。

4 胎粪样品加样处理

4.1 加样前样品混匀

样品解冻后，盖上冻存盒盖子，整板震荡，让胎粪与稀释液充分混匀，之后静置2 min，液面分成上下两层。

4.2 加样剂量

为确保酶标板中样品反应时间一致，将待检胎粪样品按照一定顺序加入到一次性反应板孔内，加样时要吸取上清液150 μL，切忌样品混有沉淀。如果有的待检样品上清液量不足，则可倾斜离心管贴壁吸取上清液；如果上述操作后上清液吸取量还是达不到要求，则可在待检胎粪样品中加入0.2 mL稀释液。

4.3 记录信息

加样人员每加完一板胎粪样品后，需在一次性反应板和冻存盒上标清楚对应的品系及板号，并将各个板和冻存盒按着顺序码放在固定的位置上，便于实验人员、数据统计人员进行操作，以便应对突发情况。每块反应板中胎粪样品信息由专人负责登记，需详细记录检测的第几板、品系、家系、加样人姓名等相关信息。

5 胎粪样品实验室检测流程

5.1 试剂盒操作流程

胎粪样品禽白血病p27检测严格按照试剂盒实验操作说明书进行，检测前将试剂盒置于25 ℃恒温箱中回温2.5 h，确保试剂结晶完全融化后方可使用。

5.2 检测流程的控制

5.2.1 人员合理分配 出雏后4 h内完成鸡只胎粪样品检测工作，以确保雏鸡的健康。由于检测任务比较重、时间紧迫，需合理组织与安排人员，做好ELSIA实验检测流程的管控与记录，确保试验顺利进行，保证检测结果的准确性。检测人员分为2组，实施8 h工作交替。两组各环节的负责人需要交接工作进程，保证每个环节能够有条不紊地开展下一阶段的工作。

5.2.2 温度的控制 实验过程中酶标板需在恒温中孵育，温度直接影响酶的活力，是酶标反应实验中关键项，其注意事项为：一是保证实验前将试剂盒中各个试剂及酶标板在室温（25～28℃）回温2.5 h；二是样品检测过程中，确保酶标板的每一个反应环节均在试剂盒要求的温度下进行。

5.2.3 时间的控制 为准确把握检测中每个环节的反应时间，每次加完试剂后均使用计时器计时，并且实验操作中要不断计算各板之间的时间间隔，合理安排每块板的时间，保证实验时间的准确性。

6 检测数据的统计及反馈

数据统计人员首先将胎粪样品编号提前输入EXCEL表格中，输号期间需要两个人密切配合核对数据，确保每一份样品编号准确。检测完毕后将检测数据从软件中导出，并将其与输入的样品编号进行合并，筛选出阳性鸡只的编号。数据统计后，经负责人审核确认无误后，方可将检测的阳性编号反馈给生产负责人。

7 鸡只淘汰方法

雏鸡出壳后，严格筛选出健康鸡只，同一个小家系的雏鸡放入一个带有透气孔的纸袋内，标记家系号。经过免疫后的雏鸡按照家系号顺序放置在出雏场地，然后按照家系分类每只雏鸡装入一个带有透气孔的纸袋中，并放在白色塑料筛上。待检测结果反馈后，及时淘汰阳性鸡。需注意：同一只母鸡所产雏鸡中有一只阳性鸡就要全部淘汰同纸袋中雏鸡，同时追溯到种鸡，淘汰相应的种母鸡。最终，将健康的鸡只运送至育雏场。

8 结论

禽白血病的水平传播主要发生在孵化期间和出雏后的前两周内，尤其是雏鸡出壳后48 h内具有很强的传染性、传播性，因此，1日龄胎粪检测是禽白血病净化程序最重要的一环，是“重中之重”[3]。本研究梳理出一套适合规模化养殖场1日龄雏鸡胎粪禽白血病检测流程，且在禽白血病净化生产应用中也取得了较好的效果，为国内种鸡场禽白血病净化的示范推广提供技术支持。