分子标记辅助选择创制小麦抗白粉病基因聚合体

高月，郭秀林，赵敏，李国良*

（1.河北工程大学园林与生态工程学院，河北 邯郸 056000；2.河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所/河北省植物转基因中心重点实验室，河北 石家庄 050051）

小麦为世界主要粮食作物之一，其高产、稳产是维护粮食安全与社会稳定的重要保障。由于耕作、气候等因素的影响，致使小麦白粉病、锈病、赤霉病等频发，严重影响小麦产量和品质[1]。小麦白粉病是由小麦白粉病菌Blumeria graminis f.sp.tritici引起的一种气传性真菌病害，流行范围广、强度高、变异快，造成小麦大幅度减产，欧美病害严重地区小麦减产高达20%，在亚洲、非洲等冷凉及温暖潮湿地区也均严重发生[2]。小麦对白粉病的抗性是由抗病基因决定的，因此，携带何种抗白粉病基因是决定小麦抗病与否的关键。传统育种方法选择周期长，且效率低。利用分子标记辅助选育抗病基因聚合小麦新种质，可缩短育种周期，提高基因检测准确率。

目前，国际玉米和小麦改良中心已记载大量与抗病相关的分子标记，有100多个白粉病抗性基因（Pm）和等位变异基因被鉴定，156个QTL被定位[3，4]，但只有部分Pm基因表现出有效抗性。来源于阿富汗地方小麦品种的抗白粉病基因Pm59，对美国大平原发生的小麦白粉病产生有效的抗病性[5]。济麦23含有抗白粉病基因PmJM23，该基因具有白粉病广谱抗性，位于5D染色体的短臂上，烟台大学利用济麦23创制了一系列农艺性状优良且高抗白粉病的种系[6]。曹廷杰等[7]发现Pm2或其等位基因抗性较好且比较稳定，适合在我国部分麦区发挥抗病优势。Pm21源于簇毛麦（Heuchera villosa）染色体6V的短臂，对绝大多数白粉菌生理小种表现免疫，在我国北方冬麦区具有有效的广谱抗性，且不同的遗传背景下抗病表现稳定，是已知最好的抗白粉病基因[8]。Pm35源于粗山羊草（Aegilops tauschii），定位于染色体5D的长臂，与同在5D染色体上的Pm2和Pm34对白粉菌的反应不同，遗传上独立[9]。良星99先后通过河北省、国家品种审定，是我国北方重要的小麦品种[4]，因携带2B染色体长臂单基因Pm52，对白粉病表现高抗[10]。

自然界白粉病原菌不断变异，但小麦品种抗源单一，单个基因抗性逐渐丧失，造成病害传播速度快、范围广，流行趋势难以控制。为了预防和应对不断变异的白粉病，育种工作者越来越重视聚多个抗白粉病基因于一体的新种质创制。美国、英国、加拿大等均通过抗病基因聚合育成了小麦抗病新品种[11]。我国也有科研工作者进行了抗白粉病基因聚合研究。高安礼等[12]创制了一批聚合多基因的抗病植株，如Pm2+Pm4a+Pm21、Pm2+Pm21、Pm4a+Pm21、Pm2+Pm4a，这些基因单独存在时抗性低，但聚合后抗性表现较好。董娜等[8]利用分子标记辅助选择技术进行了Pm21与Pm13抗病基因聚合，抗性鉴定结果表明，聚合Pm21与Pm13的株系抗病性良好，整体表现免疫或高抗，Pm21对小麦白粉病的抗性优于Pm13，且聚合后基因间不存在负向作用。因此，利用分子标记辅助选择技术将多个抗白粉病基因聚合，可提高小麦抗病性，有效防治白粉病。

以携带不同抗白粉病基因的小麦品种为供体，以携带抗白粉病基因的当地小麦主栽品种为受体材料，采用两两杂交、回交的方法，利用分子标记辅助选择技术进行抗白粉病基因聚合，创制携带多个抗病基因的新种质，可为小麦抗病育种提供种质资源，对于减少小麦生产损失，降低农药用量和残留，以及提升社会、经济和生态效益均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 小麦材料

抗白粉病基因Pm21的供体亲本为金禾9123，抗白粉病基因Pm35的供体亲本为普冰01；受体亲本为良星99，携带抗白粉病基因Pm52。

1.2 试验方法

1.2.1 两两杂交法聚合抗白粉病基因 以小麦骨干品种良星99为受体亲本，分别以金禾9123和普冰01为供体亲本，两两杂交获得F1代；F1代之间再进行杂交，获得三亲本杂交系；再利用三亲本杂交系与良星99进行回交转育，创制含有2个及以上抗病基因的新种质材料。

1.2.2 小麦基因组DNA的提取 取小麦叶片0.1 g置于2 mL离心管中，液氮冷冻后磨碎，采用CTAB法[13]提取小麦基因组DNA。

1.2.3 分子标记辅助选择鉴定抗病基因 搜索与抗病基因Pm21、Pm35和Pm52连锁的分子标记[14，9，15]，在供体亲本和受体亲本之间进行多态性检测。以小麦叶片基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增体系为2×Flash Hot Start Master Mix 5 μL、引物0.2 μmol/L、模板DNA 40～60 ng，用dd·H2O补至10 μL。反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，57℃（Pm21SCAR1265，Xcfd26）/60℃（Xgwm120）退火40 s，72℃延伸1 min，共38个循环；72℃充分延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳（Pm21）或8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Pm35和Pm52），经银染、显色步骤，检测扩增产物。

2 结果与分析

2.1 分子标记有效性鉴定

参照已有与抗病基因Pm21、Pm35和Pm52紧密连锁的分子标记，在供体亲本和受体亲本之间进行多态性检测，各筛选到1对有效的紧密连锁标记，分别为Pm21SCAR1265、Xcfd26和Xgwm120（表1）。其中，Pm21SCAR1265为SCAR标记，在金禾9123中能扩增出长度为1 265 bp的特异DNA条带，在普冰01和良星99均无特异条带扩增；Xcfd26和Xgwm120为SSR标记，分别在普冰01和良星99中扩增出特异DNA带型（图1）。

图1 利用不同分子标记对小麦3个亲本的多态性检测结果Fig.1 Polymorphism identification results of three parents of wheat using different molecular markers

表1 分子标记及其信息Table 1 Molecular marker and related information

2.2 分子标记辅助选择聚合抗白粉病基因株系

利用筛选到的分子标记Pm21SCAR1265、Xcfd26和Xgwm120分别对3个亲本杂交又回交良星99的BC1F1材料进行鉴定，结果显示，利用标记Pm21SCAR1265鉴定出带型与含有抗病基因Pm21供体亲本金禾9123一致的材料3株，分别为3、10和11（图2）；利用标记Xcfd26鉴定出带型与含有抗病基因Pm35供体亲本普冰01一致的材料3株，分别为4、10和13（图3）；利用标记Xgwm120鉴定出与含有抗病基因Pm52供体亲本良星99一致的材料14株，分别为1、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16和17（图4）。综合3个分子标记鉴定结果，获得聚合3个抗白粉病基因（Pm21+Pm35+Pm52）的株系1个（10）；聚合2个抗白粉病基因的株系4个，其中聚合基因Pm21+Pm52的株系2个（3和11），聚合基因Pm35+Pm52的株系2个（4和13）。

图2 利用分子标记Pm21SCAR1265对三亲本杂交后回交材料BC1F1的检测结果Fig.2 Identification results of molecular marker Pm21SCAR1265 in BC1F1 of three parents hybridation and backcross

图3 利用分子标记Xcfd26对三亲本杂交后回交材料BC1F1的检测结果Fig.3 Identification results of molecular marker Xcfd26 in BC1F1 of three parents hybridation and backcross

图4 利用分子标记Xgwm120对三亲本杂交后回交材料BC1F1的检测结果Fig.4 Identification results of molecular marker Xgwm120 in BC1F1 of three parents hybridation and backcross

3 结论与讨论

虽然已经有100多个白粉病抗性基因（Pm）和等位变异基因被鉴定，但截至目前只有Pm1、Pm2、Pm3、Pm5、Pm8、Pm17、Pm21、Pm24、Pm38、Pm41、Pm46和Pm60这12个基因被克隆[4]，其中根据Pm21开发的SCAR分子标记Pm21SCAR1265是检测Pm21基因有效的分子标记[14，15]，我们的试验结果也证明了该分子标记的有效性。Pm35和Pm52均已被精细定位[4，16]，并分别开发了有效的分子标记Xcfd26和Xgwm120，在检测Pm35和Pm52时均有特异带型。由此可见，分子标记Pm21SCAR1265、Xcfd26和Xgwm120是有效的分子标记，可以用来鉴定小麦杂交后代材料中抗白粉病基因Pm21、Pm35、Pm52是否成功导入。利用有效的分子标记检测杂交后代，可准确、高效地检出目标基因，加速多个抗白粉基因聚合的小麦抗病育种进程。

在生产上，为了提高小麦产量，常采用增加种植密度和水肥用量等措施，而这些措施均有利于白粉病的传播。在大部分麦区，小麦白粉病已发展成为一种常见病害。Pm8来源于黑麦，对小麦白粉病抗性好，早期被广泛用于小麦抗白粉病育种[17]。其后，Pm2、Pm4、Pm12、Pm13、Pm16、Pm20、Pm21、Pm35和Pm52等抗白粉病基因均被应用到小麦抗病育种[17，18]，其中Pm21、Pm35和Pm52是目前在生产实践中有效的抗病基因，包含它们任何一个基因的小麦品种均对白粉病高抗甚至免疫[4，8，9，17]。在自然环境下，小麦白粉病菌变异快，很容易导致含有一个抗白粉病基因的小麦品种失去抗性。如Pm8过度利用，致使其对我国大部分麦区的小麦白粉病抗性已经丧失[17]。因此，创制多个抗白粉病基因聚合的新种质进而培育聚合多个抗病基因的小麦新品种，是增强小麦持久抗病性的有效途径。携带Pm21的金禾9123和携带Pm52的良星99是我国黄淮冬麦区国审推广品种，不仅高抗白粉病，而且产量和农艺性状也表现良好[17，19]。本研究通过两两杂交、回交的方法，获得了聚合Pm21、Pm35和Pm52这3个抗病基因的新种质。后续将在田间对获得的材料进行抗病鉴定试验，为利用多个抗白粉病基因进行抗病育种提供种质资源。

综上所述，利用分子标记辅助选择技术创制多基因聚合的抗白粉病新种质，不仅可以解决传统表型鉴定难以快速并准确选择2个及以上抗病基因个体的问题，还能加速抗病育种进程，提高育种效率，为小麦抗病育种提供抗性更广谱且更持久的种质材料。这对于减少小麦生产损失，降低农药用量，提升社会、经济和生态效益，以及保障国家粮食安全均具有重要的现实意义。