Pita、Pib 在宁夏及引进水稻种质资源中的分布及与穗颈瘟抗性的关系

李晓蓉，苏思荣，张银霞，张振海，田 蕾，罗成科，李培富

（1. 宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；2. 宁夏农林科学院 农作物研究所，宁夏 永宁 750105）

2014—2019 年，宁夏回族自治区水稻种植面积稳定在7.33 万hm2，总产量稳定在60 万t 左右[1]。水稻生长发育过程中会遭遇病虫害，病虫害的发生直接影响水稻产量及品质，尤其由稻瘟菌（Magnaprthe grisea）引发的稻瘟病是最具有杀伤力的水稻病害，造成全球水稻产量平均每年减少10%～30%，严重时达40%～50%，甚至绝产[2-3]。其中，穗颈瘟对水稻产量和品质的威胁最大。穗颈瘟发生在水稻穗颈处，感染时期一般在水稻抽穗破口前，在抽穗后稻瘟菌侵入穗部形成褐色小点，后期逐渐扩展到整个穗颈，使穗颈坏死，阻断养分和水分的输送，从而形成瘪粒或白穗，严重影响水稻产量，甚至会造成绝收[4]。长期的生产实践表明，在众多的防治措施中，选育和推广抗病品种是防治该病流行最经济、有效的手段[5-6]。对作物品种培育而言，抗病基因的发掘与利用是提高抗病能力的基础和核心。

随着分子生物学的快速发展，定位并克隆抗稻瘟病基因是开展抗病育种的重要前期工作。至今，已克隆的抗稻瘟病基因39 个，包括Pib、Pita、Pi2、Pi36、Pi37等，大多数分布在水稻第1、6、11 染色体上[7-12]。其中，Pib是首个被克隆的抗稻瘟病基因［13］，位于水稻第2 染色体长臂近末端区域，与Pita基因有43.2%的相似性[14]；Pita基因位于水稻第12 染色体靠近着丝点的区域［15］。Pib和Pita是抗稻瘟病的主效基因，在我国很多稻区表现出高水平的稻瘟病抗性。王军等［16］研究发现，Pita、Pib基因与穗颈瘟抗性呈正相关，同时聚合Pita和Pib在一定程度上能够进一步提高江苏省粳稻的穗颈瘟抗性。李忠楠等[17]、王远平[18]研究也发现，Pita基因与穗颈瘟抗性呈显著正相关。范方军等［19］研究发现，含Pita或Pib基因水稻材料的穗颈瘟抗性水平无4级高感，而其他抗性基因组合材料的穗颈瘟抗性水平一般都存在4 级高感。然而，Pita和Pib基因在宁夏回族自治区水稻种质资源中的分布及与穗颈瘟抗性的关系尚不明确。为此，以85份宁夏回族自治区当地的水稻种质资源和引进的水稻种质资源为试验材料，对其稻瘟病抗性进行鉴定，分析Pita、Pib基因及其组合的分布，并探讨Pita、Pib基因及其组合与穗颈瘟抗性的关系，明确这2 个基因在水稻抗颈瘟病方面的价值，为通过分子标记辅助选择培育抗穗颈瘟水稻新品种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料为85份水稻种质资源，包括宁夏回族自治区当地的水稻种质资源（48 份）和引进的水稻种质资源（37 份，在宁夏回族自治区已种植超过7 a）。编号1—85 对应的种质分别为宁粳41 号、有芒大琥板稻、2013-409、SD-4、SD-2、84-275、宁粳29 号、宁粳40 号、黑兰稻、叶盛白皮大稻、小红板稻、大琥板稻、白皮小稻、宁资218、2013-1120、黑香米、优引3 号、宁粳16 号、宁粳25 号、宁粳47 号、宁稻216、宁香稻1 号、宁香稻2 号、花育2 号、花94、花117、鉴1346、89XW-216、2009XZ-588、2007XZ-181、2012-131、宁大62、宁粳7 号、宁粳14 号、宁粳15号、宁粳27号、宁粳32号、宁粳36号、宁粳37号、宁粳43 号、宁粳44 号、宁香稻3 号、毛毛稻、宁粳5号、小糯稻、小琥板稻、宁香优2 号、农科843、沈稻121、花119、沈农389、节11、鉴17、京宁2 号、京宁6号、京宁7 号、通亲08-4042、优育41、宁资460、杨和白皮稻、空育131、龙粳21、龙粳31、龙粳36、春优1号、通98-56、通系929、吉粳108、盐丰47、香粳2号、松辽6号、松辽7号、秋田小町、富源4号、地谷、梅谷、圣稻13、圣稻14、圣稻15、圣稻16、圣稻17、圣香稻2572、降糖稻、LDC355、宁粳42号。

供试菌株为在宁夏回族自治区水稻种植区（贺兰、平罗、青铜峡、中卫、银川）采集的稻瘟病病原菌，经实验室分离培养鉴定后得到具有致病性强且致病率高的稻瘟病菌（宁夏大学农学院植保实验室李文强老师馈赠）。

供试培养基为PDA 和稻谷粉培养基。PDA 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂40.5 g/L。稻谷粉培养基：磨碎稻谷20 g/L、酵母粉20 g/L、琼脂15 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 水稻种质资源的种植及稻瘟病菌菌株的培养 2019 年4 月将85 份水稻种质资源种植在宁夏大学实验基地（38.28°N、106.24°E）。每个材料种2行，每行10 株，株距10 cm，行距26 cm，每隔2 行种1 行诱发材料杨和白皮稻，四周种植诱发材料杨和白皮稻。将供试菌株接种在PDA 培养基上，编号并记录接种日期，放置于28 ℃恒温培养箱中进行24 h光照培养。培养约14 d 使菌丝长满培养皿，将其转接到稻谷粉培养基上置于28 ℃恒温培养箱中进行12 h光照、12 h黑暗交替培养，让其充分产孢。然后配制稻瘟病菌孢子悬浮液：用灭菌水清洗所有培养皿中孢子，经3层灭菌纱布过滤，然后将孢子浓度调整至2×105个/mL备用，在接种前向悬浮液中加入1～2滴吐温-20以保证液体的黏附性，注意孢子悬浮液需现配现用。

1.2.2 水稻种质资源稻瘟病抗性鉴定 采用人工接种和自然诱发相结合的方法进行稻瘟病抗性鉴定。在分蘖初期和盛期调查3 次叶瘟，在抽穗期及黄熟期调查2 次穗颈瘟。叶瘟的调查：在每个小区以发病最重的10 株的平均发病等级作为该品种的抗性级别；穗颈瘟的调查：在每个小区内随机抽查10株，记录发病率和病级。叶瘟和穗颈瘟的分级标准参照《水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程》[20]。然后按照国际水稻所（IRRI）稻瘟病抗性综合评价标准对供试水稻种质资源的稻瘟病抗性进行综合评价（稻瘟病综合指数=叶瘟病级平均指数×25%+水稻发病率群体抗性级别×25%+穗颈瘟的损失率×50%）[20]。综合指数越高，越易感病。具体标准见表1。

表1 稻瘟病抗性综合评价分级标准Tab.1 Classification criteria for comprehensive evaluation of rice blast resistance

1.2.3 水稻种质资源Pita和Pib基因的分子检测

在分蘖期，每份水稻种质资源随机选取1株，采集叶片并编号。采用SDS 法提取叶片总DNA，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的质量和浓度，然后进行PCR 扩增。Pita和Pib基因SNP 标记引物序列参考文献[21-22]，详见表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反应体系（20µL）:10×Buffer（含Mg2+）2.0µL，2.5 mmol/L dNTP 0.4µL，上、下游引物（2 µmol/L）各1.0 µL，Taq酶0.2 µL，DNA 2.0 µL，最后用ddH2O 补足20 µL。PCR 反应程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，58.2 ℃30 s，72 ℃1 min，36 个循环；72 ℃10 min。PCR 扩增产物采用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，然后在紫外灯下拍照并记录结果。

表2 稻瘟病抗性基因分子标记引物序列Tab.2 Primer sequence of molecular markers of rice blast resistance genes

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2019 进行处理和制图，采用DPS软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 宁夏回族自治区及引进水稻种质资源稻瘟病抗性鉴定

2.1.1 穗颈瘟和叶瘟抗性鉴定 对85 份水稻种质资源进行穗颈瘟和叶瘟抗性鉴定，发现85份水稻种质资源对叶瘟和穗颈瘟的抗性存在明显差异（图1和表3）。对叶瘟表现为高抗、抗、中抗、中感、感、高感的水稻种质资源分别有28、23、15、11、7、1 份，分别 占 总 数 的32.94%、27.06%、17.65%、12.94%、8.23%、1.18%。可见抗叶瘟的水稻种质资源有66份，抗病率为77.65%。对穗颈瘟表现为高抗、抗、中抗、中感、感、高感的水稻种质资源分别有16、1、23、21、13、11 份，分 别 占 总 数 的18.82%、1.18%、27.06%、24.71%、15.29%、12.94%。可见抗穗颈瘟的水稻种质资源有40份，抗病率为47.06%。

图1 宁夏回族自治区及引进水稻种质资源叶瘟和穗颈瘟抗性鉴定Fig.1 Identification of leaf and neck blast resistance of Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

2.1.2 稻瘟病综合抗性评价 对85 份水稻种质资源进行稻瘟病抗性综合评价，发现不同水稻种质资源稻瘟病综合抗性存在明显差异（表3）。85份水稻种质资源中，对稻瘟病表现为抗、中抗、中感、感、高感的水稻种质资源分别有33、23、11、7、11 份，分别占总数的38.82%、27.06%、12.94%、8.24%、12.94%。可见大部分（56 份）水稻种质资源对稻瘟病表现为抗（33 份）和中抗（23 份），抗病材料多于感病材料，综合抗病率为65.88%。

表3 宁夏回族自治区及引进水稻种质资源叶瘟、穗颈瘟及综合抗性评价Tab.3 Comprehensive evaluation of rice blast resistance of Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

续表3 宁夏回族自治区及引进水稻种质资源叶瘟、穗颈瘟及综合抗性评价Tab.3（Continued） Comprehensive evaluation of rice blast resistance of Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

续表3 宁夏回族自治区及引进水稻种质资源叶瘟、穗颈瘟及综合抗性评价Tab.3（Continued） Comprehensive evaluation of rice blast resistance of Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

2.2 宁夏回族自治区及引进水稻种质资源Pita和Pib基因的分子检测

图3 Pib基因在部分宁夏回族自治区及引进水稻种质资源中的分子检测Fig.3 The molecular detection of Pib gene in some Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

利用Pita和Pib基因分子标记对供试水稻种质资源进行分子检测（图2—3、表4）。结果表明，85份水稻种质资源中有59份含有Pita基因，占总数的69.41%；有26 份不含Pita基因，占总数的30.59%。85 份水稻种质资源中也有59 份含有Pib基因，占总数的69.41%。85 份水稻种质资源中有42 份同时含有Pita和Pib基因，占总数的49.41%；有34 份含有其中1 个基因，占总数的40.00%，其中只含有Pita、Pib基因的各有17 份；有9 份既不含有Pita基因 也不含有Pib基因，占总数的10.59%。

图2 Pita基因在部分宁夏回族自治区及引进水稻种质资源中的分子检测Fig.2 The molecular detection of Pita gene in some Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

表4 Pita和Pib在宁夏回族自治区及引进水稻种质资源中的分布Tab.4 Distribution of Pita and Pib genes in Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

续表4 Pita和Pib在宁夏回族自治区及引进水稻种质资源中的分布Tab.4（Continued） Distribution of Pita and Pib genes in Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

2.3 Pita、Pib基因与穗颈瘟抗性的关系

结合水稻种质资源的穗颈瘟抗性鉴定结果和Pita、Pib基因的检测情况，发现基因组合为Pita+/Pib+的水稻种质资源对穗颈瘟的抗病率为40.47%，基因组合为Pita+/Pib-的水稻种质资源对穗颈瘟的抗病率为70.59%，基因组合为Pita-/Pib+的水稻种质资源对穗颈瘟的抗病率为47.06%，而基因组合为Pita-/Pib-的水稻种质资源对穗颈瘟的抗病率为33.33%（表5）。可见携带Pib、Pita基因的水稻种质资源对穗颈瘟的抗病率高于不携带Pita和Pib基因的水稻种质资源；另外，只携带Pita基因的水稻种质资源对穗颈瘟的抗病率高于只含Pib基因的水稻种质资源。对宁夏水稻种质资源穗颈瘟抗性与其携带的抗性基因进行相关性分析，发现Pib基因与穗颈瘟抗性没有显著的相关性（r=0.453，P＞0.05），Pita基因与穗颈瘟抗性有显著的相关性（r=0.481，P＜0.05）。

表5 不同Pita、Pib基因组合的穗颈瘟抗性Tab.5 Neck blast resistance of different combinations of Pita and Pib genes

2.4 Pib、Pita基因与稻瘟病综合抗性的关系

由表6 可知，基因组合为Pita+/Pib+的水稻种质资源中抗稻瘟病的有29 份，抗病率为69.05%；基因组合为Pita+/Pib-的水稻种质资源中抗稻瘟病的有14 份，抗病率高达82.35%；基因组合为Pita-/Pib+的水稻种质资源中抗稻瘟病的有9 份，抗病率为52.94%；基因组合为Pita-/Pib-的水稻种质资源中抗稻瘟病的有4 份，抗病率为44.44%。可见只携带Pita或Pib基因及同时携带Pita和Pib基因的水稻种质资源稻瘟病综合抗病率均明显高于不携带Pita和Pib基因的水稻种质资源，综合抗病率表现为Pita+/Pib-＞Pita+/Pib+＞Pita-/Pib+＞Pita-/Pib-。说 明Pita和Pib基因可以明显提高稻瘟病抗性，且Pita基因的抗性效果明显好于Pib基因。

表6 不同Pita、Pib基因组合的稻瘟病综合抗性Tab.6 Comprehensive resistance of different combinations of Pita and Pib genes to rice blast

3 结论与讨论

利用抗稻瘟病基因的分子标记进行辅助选择育种已有很多报道，且在水稻抗性育种中已普遍应用。王东元等[23]对辽宁省和天津市两地栽培的107份粳稻材料进行抗稻瘟病特异性检测，发现Pib基因分布较广泛，分布频率为50%，而Pita基因分布较少，分布频率为38%；岂长燕等［24］对抗稻瘟病基因Pib、Pita、Pi5、Pi25和Pi54在我国水稻微核心种质中的分布情况进行检测，发现Pita和Pib基因的频率分别为15.69%和7.84%。本研究发现，85 份宁夏回族自治区及引进水稻种质资源中携带Pita、Pib基因的种质均占总数的69.41%。

陈涛等[25]通过对618 份粳稻新品系进行研究发现，穗 颈 瘟 抗 性 表 现 为Pita+/Pib+＞Pita+/Pib-＞Pita-/Pib+＞Pita-/Pib-。本研究在明确Pita和Pib基因在水稻种质资源分布的前提下，进一步从基因组合方向探究其在稻瘟病抗病育种中的利用价值。对85 份宁夏回族自治区及引进水稻种质资源中的4种不同基因组合和稻瘟病综合抗病性进行分析，发现有42份水稻种质资源同时含有Pita和Pib基因，有34 份水稻种质资源只含有其中1个基因，9份水稻种质资源既不含有Pita基因也不含有Pib基因。基因组合为Pita+/Pib+的水稻种质资源对穗颈瘟的抗病率为40.47%，对稻瘟病的综合抗病率为69.05%；基因组合为Pita+/Pib-的水稻种质资源对穗颈瘟的抗病率为70.59%，对稻瘟病的综合抗病率为82.35%；基因组合为Pita-/Pib+的水稻种质资源对穗颈瘟的抗病率为47.06%，对稻瘟病的综合抗病率为52.94%；基因组合为Pita-/Pib-的水稻种质资源对穗颈瘟的抗病率为33.33%，对稻瘟病的综合抗病率为44.44%。不同基因组合对穗颈瘟的抗性表现为Pita+/Pib-＞Pita-/Pib+＞Pita+/Pib+＞Pita-/Pib-，对稻瘟病的综合抗性表现为Pita+/Pib-＞Pita+/Pib+＞Pita-/Pib+＞Pita-/Pib-。表明水稻种质资源中只含有Pita或Pib基因对穗颈瘟的抗病率都较高，而当Pita和Pib基因聚合于同一材料时，穗颈瘟抗病率不升反降，说明Pita与Pib聚合有一定的负效应，这与李耀栋等[26]的研究结果类似，而与王军等［16］、陈涛等[25]的研究结果相反。因此，继续深入挖掘与稻瘟病相关的抗性基因，对进一步提高水稻稻瘟病抗性水平具有重要意义。

孙立亭等[27]利用分子标记检测703 份江苏省水稻材料所携带的5 个抗病基因，并分析抗病基因的不同聚合方式与稻瘟病抗性是否存在一定的相关性，结果表明，抗稻瘟病基因数与稻瘟病抗病率呈正相关。王军等[28]利用分子标记检测江苏省部分水稻品系中的Pita和Pib基因，发现这2个基因与水稻穗颈瘟的抗病性呈正相关，同时携带这2 个基因可以大大提高穗颈瘟的抗病性。本研究发现，Pib基因与穗颈瘟抗性没有显著的相关性，Pita基因与穗颈瘟抗性有显著的相关性，这与王远平[18]的研究结果相同，与王军等[28]的研究结果不完全相同。

综上，Pita基因可以用于宁夏回族自治区水稻抗穗颈瘟育种，同时在生产上Pita基因也可以和Pib基因相结合，用于抗稻瘟病的基因聚合育种。