混菌发酵对口含烟原料提质降害研究

杨 静，李书贵

(1.贵州省烟草公司黔东南州公司，贵州凯里 556000；2.黔东南州烟草公司施秉县分公司，贵州施秉 562000)

烟叶中烟碱(nicotine)的含量占总植物碱含量的95%以上，是影响烟叶品质的特征性指标之一[1]。烟碱的含量与烟民的健康密切相关，含量过高可能会对身体健康产生严重危害[2]。近年来，随着国内外控烟形势的日益严峻，口含烟成为烟草工业企业的重要研究方向之一。口含烟产品质量安全监控的重要指标之一就是烟碱的释放量[3]，同时烟碱对味觉具有很重要的影响，尤其在口含烟中，游离烟碱直接透过口腔黏膜被人体吸收，刺激人脑多巴胺的产生，从而增加人的满足感[4]。在烟叶中烟碱含量偏高，导致放入口中使用时刺激性、辛辣味较重，烟碱含量的降低有利于降低烟草原料的辛辣感，从而改善口含烟的刺激感。有学者利用烟草土壤为试验材料，从中筛选提取一株有效降解烟碱的微生物，并且进行了鉴定、确定其最佳生长条件及其降解烟碱最大的发酵条件，其降解率能达到82%[4-7]。也有学者研究发现，微生物对烟叶化学成分和评吸品质有一定的影响，能够降低烟叶烟碱含量，对提高香气量、改善香气质有很好的作用[2，8-11]。现代发酵工业中，纯种发酵占很大的比例[12]。但在长期的试验和生产实践中，人们不断地发现很多重要生化过程仅靠单株微生物不能完成或只能微弱地进行，必须依靠2种或多种微生物共同培养来完成，即混菌培养或称为混菌发酵。混菌发酵是采用2种或多种微生物的协同作用共同完成某发酵过程的一种新型发酵技术，是纯种发酵技术的新发展，也是一种不需要进行复杂的DNA体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术。目前很多研究表明混合菌种发酵的产品品质明显强于单一菌种发酵[13-19]。该研究通过以解淀粉芽孢杆菌GUHP86、枯草芽孢杆菌B01复合菌进行口含烟烟草原料发酵试验，通过控制菌种比、接种量、有糖盐溶液添加量，以发酵后烟碱含量为指标，优化发酵工艺，并对发酵后烟草原料进行感官品评，从嗅香、满足感、口感特征、异味、口腔余香5个方面对发酵后烟草原料进行一个比较全面的评价，综合评价混菌发酵口含烟烟草原料的烟碱含量及感官品质。

1 材料与方法

1.1 供试材料解淀粉芽孢杆菌GUHP86、枯草芽孢杆菌B01来自贵州大学酿酒与食品工程学院实验室保藏菌株。口含烟烟草原料选用贵州省黔东南州烟区生产的云烟87上、中部叶片(B2F、C3F)。将叶片用水清洗掉表面的灰尘和杂质后分别放入烘箱中在 40 ℃以下低温烘干，粉碎密封保存。

1.2 菌株培养种子培养液：胰蛋白胨 0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化钠2.5 g、葡萄糖 0.25 g、蒸馏水400 mL，加热溶解，均等装入小锥形瓶各20 mL，于121 ℃、20 min灭菌，取出冷却。冷却后，将培养好的菌株(在无菌操作台中)分别加至小锥形瓶中，每瓶一株菌(液体保藏菌接2 mL)，盖好，写上标签，放入摇床中37 ℃培养12 h，用于第2天接菌进入烟叶。

1.3 烟叶发酵工艺

1.3.1制备种子液。准确称取胰蛋白胨1.25 g、酵母提取物0.625 g、NaCl 6.25 g、葡萄糖0.625 g，加入1 000 mL容量瓶定容至刻度，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，待冷却后接入菌种，180 r/min 37 ℃进行培养18 h，最终得到植物乳杆菌SQ-4种子液活菌浓度为9.52 CFU/mL、解淀粉芽孢杆菌GUHP86种子液活菌浓度为9.58 CFU/mL、枯草芽孢杆菌B01种子液活菌浓度为9.56 CFU/mL。

1.3.2烟草原料发酵工艺。图1为烟叶的发酵工艺。用水将烟叶表面的灰尘和杂质清洗后放入烘箱中在 40 ℃以下低温烘干，打磨成粉，称取20 g装入14 cm×10 cm的无菌密封袋，灭菌备用。在无菌操作台中将培养好的菌株分别放入均等的大离心管中，于8 000 r/min离心10 min。离心以后，倾倒出上清液，保留菌体，用已灭菌的生理盐水20 mL加至此离心管中，摇匀。吸取适量离心管内菌液于装有已灭菌的烟粉塑封袋内，适量加入盐溶液，充分混匀，贴上标签放入恒温培养箱内进行发酵，每天需进行换气。取样时将烟粉在120 ℃灭菌20 min后冷冻保藏[20]。

图1 烟叶的发酵工艺

1.4 单因素试验

1.4.1不同菌种比接种发酵对口含烟烟草原料中烟碱含量的影响。选用黔东南地区生产的云烟87中部叶C3F为口含烟烟草原材料，分别称取发酵烟草原料20 g，按1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1比例添加混合菌种6 mL，空白试验不添加微生物添加4 mL有糖盐溶液，每组混菌试验添加有糖盐溶液4 mL，在37 ℃下发酵15 d，将发酵后烟粉在 115 ℃下灭菌 20 min，测定其烟碱含量，并对其进行感官评价。

1.4.2不同接菌量对口含烟烟草原料中烟碱含量的影响。选用黔东南地区生产的云烟87中部叶C3F为口含烟烟草原材料，分别称取发酵烟草原料20 g，按解淀粉芽孢杆菌GUHP86∶枯草芽孢杆菌B01为3∶1添加混合菌种，接菌量按3、4、5、6、7 mL添加，空白试验不添加菌种添加4 mL有糖盐溶液，每组混菌试验添加有糖盐溶液4 mL，在37 ℃下发酵15 d，将发酵后烟粉在115 ℃下灭菌20 min，测定其烟碱含量，并对其进行感官评价。

1.4.3有糖盐溶液添加量对口含烟烟草原料中烟碱含量的影响。选用黔东南地区生产的云烟87中部叶C3F为口含烟烟草原材料，分别称取发酵烟草原料20 g，按3、4、5、6、7 mL添加有糖盐溶液，添加解淀粉芽孢杆菌GUHP86∶枯草芽孢杆菌B01为3∶1混合菌种6 mL，空白试验不添加有糖盐溶液加入蒸馏水，在37 ℃下发酵15 d，将发酵后烟粉在115 ℃下灭菌 20 min，测定其烟碱含量，并对其进行感官评价。

1.4.4烟碱含量的测定方法。参照烟草行业推荐标准YC/T 468—2013《烟草及烟草制品 总植物碱的测定 连续流动(硫氰酸钾)法》[21]进行烟碱含量测定。

1.5 正交试验在单因素试验的基础上，选取菌种比、接种量和有糖溶液添加量作为因素进行L9(34)正交试验，优化口含烟混菌发酵工艺。

1.6 数据分析与处理试验数据采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析，结果以平均值±标准偏差表示，n=3。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1不同菌种比接种发酵对口含烟烟草原料中烟碱含量的影响。由图2可知，按照“1.4.1”的方法及条件进行试验，添加菌种能够明显降低口含烟烟草原料中烟碱含量，当解淀粉芽孢杆菌GUHP86∶枯草芽孢杆菌B01为3∶1添加混合菌种发酵时，烟碱含量最低(1.52%)，烟碱降解率最高(45.91%)，相对单菌发酵有所提高。同时当解淀粉芽孢杆菌GUHP86∶枯草芽孢杆菌B01为3∶1添加混合菌种发酵时，其感官评分最高，为92分，其综合口感和香气比较和谐(表1)。

表1 不同菌种比条件下感官评定结果

图2 不同菌种比对口含烟烟草原料中烟碱含量的影响

2.1.2不同接菌量对口含烟烟草原料中烟碱含量的影响。试验结果表明(图3和表2)，接菌量对发酵后烟碱的降解率、原料的感官评价是有影响的，随着接菌量的增加，发酵后口含烟烟草原料中烟碱含量逐渐降低，当接菌量为6 mL时，发酵后口含烟烟草原料中烟碱含量最低(1.50%)，烟碱降解率最高(47.37%)，相对单菌发酵有所提高；当接菌量超过6 mL 时烟碱降解率降低。同时从表2可以看出，当接种量为6 mL时，其感官评分最高，为93分，嗅香、口腔余味提升。

表2 不同接菌量条件下感官评定结果

图3 不同接菌量对口含烟烟草原料中烟碱含量的影响

2.1.3有糖盐溶液添加量对口含烟烟草原料中烟碱含量的影响。从图4可以看出，随着有糖盐溶液添加量的增加，发酵后口含烟烟草原料中烟碱含量逐渐降低，当有糖盐溶液添加量为4 mL时，发酵后口含烟烟草原料中烟碱含量最低(1.46%)，烟碱降解率最高(45.52%)，相对单菌发酵有所提高；当有糖盐溶液添加量高于4 mL时烟碱降解率降低。当有糖盐溶液添加量为4 mL时，其感官评分最高，为93分(表3)。

表3 不同有糖盐溶液添加量条件下感官评定结果

图4 有糖盐溶液添加量对口含烟烟草原料中烟碱含量的影响

2.2 正交试验根据单因素试验结果，选取对口含烟烟草原料烟碱含量影响较大的 3 个因素，分别为菌种比、接菌量、有糖盐溶液添加量，采用 L9(34)正交进行试验设计。正交试验因素与水平见表4，正交试验结果见表5。

表4 正交试验因素和水平

从表5可以看出，各因素对口含烟烟草原料混菌发酵降烟碱的影响程度不同，对烟草原料发酵感官评价影响也不同，从R值可以得出其影响顺序均为A>B>C，即菌种比的影响最大，其次是接菌量，有糖盐溶液添加量影响最小。从烟碱含量及感官评分得出最佳提取条件为A3B3C1，而根据k值分析得出的最佳提取条件组合为A3B2C1，因此要对这2个组合进行3组平行对比试验，试验结果如表6所示。通过验证试验对比，组合A3B2C1比组合A3B3C1发酵口含烟烟草原料降烟碱效果更好，感官评分更高，所以可以确定最优组合为A3B2C1，当解淀粉芽孢杆菌GUHP86∶枯草芽孢杆菌B01为3∶1添加混合菌种发酵，接菌量为6 mL、有糖盐溶液添加量为4 mL 时，发酵口含烟烟草原料降烟碱效果更好，感官评价更优。

表5 正交试验结果

表6 验证试验对比

3 小结

烟碱是烟草最重要的化学成分之一，烟碱含量过高会影响口含烟产品的品质，该研究采用解淀粉芽孢杆菌GUHP86与枯草芽孢杆菌B01对口含烟烟草原料进行混菌发酵，以发酵后烟碱含量和感官评分为指标，通过监测发酵过程中烟草原料中烟碱含量变化和感官评分确定混菌发酵的条件。结果表明，经过混菌发酵后，口含烟烟草原料中烟碱含量在不同的菌种比、接菌量、有糖盐溶液添加量条件下均发生了明显的变化，在解淀粉芽孢杆菌GUHP86∶枯草芽孢杆菌B01为3∶1、接种量为 6 mL、有糖盐溶液添加量为4 mL 的条件下，37 ℃ 发酵15 d，口含烟烟草原料中烟碱含量达到最低值(1.53%)，发酵后口含烟烟草原料感官评分达到最高(94分)。这可能是发酵产生了一定活力的酶如蛋白酶，将烟叶中蛋白质分解为一些具有特殊风味的氨基酸参与微生物代谢，因此在感官上，加菌发酵烟叶较自然发酵烟叶整体更为协调，香味复杂浓烈，劲头足，刺激性小，滋味更丰富[22]。通过试验发现，混菌发酵可以提高烟草中烟碱的降解率，降低烟叶有害物质，提升烟叶质量，提高食用舒适性，使烟叶整体香味更为谐调，为烟叶的混菌发酵技术开发提供一定的理论和技术参考。