潍坊生姜茎基腐病拮抗菌株筛选及鉴定

石娜娜，袁成磊

(潍坊工程职业学院，山东 潍坊 262500)

生姜(ZingiberOfficinaleRoscoe)是一种重要的高效高产的经济作物，兼具药用和食用价值。山东省独特的地理条件非常适合生姜种植，其中潍坊地区种植面积较大，但近几年每到7、8月份都会有持续的高温阴雨天气，使生姜茎基腐病逐年加重，尤其是大雨过后，菌体孢子随雨水到处传播，导致生姜大面积死棵，严重制约着当地生姜种植业的发展，很多老姜区的生姜种植面积急剧减少，比如安丘白芬子、昌乐红河、昌邑南逄、青州东夏等。

生姜茎基腐病又称为烂脖子病，是一种典型的土传病害，为真菌性病害，对生姜产生的危害较为严重，会导致枝条或全株枯死，是继姜瘟后又一个急需解决的灾变病害。元菊丹[1]发现山东省安丘市、昌乐市等生姜栽培基地普遍发生茎基腐病，病情严重，发病率可达30%-70%，重病区大田中的生姜腐烂绝收，给姜农带来巨大的经济损失。目前通过处理生姜茎基腐病残体分离培养出多种病菌，包括瓜果腐霉、姜腐霉、群结腐霉、钟器腐霉、禾生腐霉、刺腐霉、巴特勒腐霉和德里腐霉等多种霉菌，其中印度以瓜果腐霉分布范围最广、致病性最强；斐济以群结腐霉为优势病原菌；澳大利亚多以群结腐霉和姜腐霉为主；日本的主要病原菌为姜腐霉；韩国以姜腐霉为优势病原菌[2]。国内对生姜茎基腐病的病原研究报道并不多，目前己发现的生姜茎基腐病主要致病菌为瓜果腐霉、群结腐霉以及合生腐霉[3]。刘振伟[4]发现莱芜生姜产区的病原菌即为群结腐霉。

长期以来姜农主要依赖三唑酮、甲霜灵、代森锰锌等化学农药防治茎基腐病，但长期大量的使用，使病原菌产生了严重的抗药性，同时化学农药的使用使自然生态，如水体、大气和土壤受到严重污染，部分农药残留可通过食物链进入人体，威胁人类健康[5]，因此明确该病病原、发生规律，筛选特定拮抗菌进行生物防治显得尤为重要。土壤中微生物种类多样，数量庞大，功能丰富，目前在农业生产中应用的生防微生物以芽孢杆菌居多，芽孢杆菌属微生物在自然界中种类丰富、广泛存在，同时大量研究发现该种属菌群具有促进植物生长，提高植物抗逆性等诸多功能。陈志谊[6]发现芽孢杆菌在受到外界不良环境时，可以产生耐热、耐盐、抗紫外的内生芽孢，而且由于代谢过程中产生的代谢产物具有很好的抗病促生作用，被广泛应用到生物防治中。王璐瑶[7]对筛选的5株甘薯茎腐病拮抗菌株进行鉴定，其中4株拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌，另外1株为枯草芽胞杆菌。

国家十四五规划提出要加快生态文明建设，科学利用微生物进行生物防治，以菌防菌，以菌治菌，通过安全环保的方法达到病虫害防治效果，正好符合绿色发展的理念，可以有效促进农业绿色循环可持续发展。以标准模式病原菌群结腐霉为靶标，从根际土壤中进行菌种筛选，针对病原菌筛选拮抗菌与促生菌，可为田间生姜茎基腐病的生物防治提供功能良好的潜力生防菌。将为生姜茎基腐病的生物防治提供理论依据，具有重要的理论和实践意义。

1 材料

1.1 供试土样

2020年7月-2022年9月，采集青州东夏镇及周边生姜种植区根际土壤样本200 份。

1.2 供试病原菌

群结腐霉(Pythiummyriotylum)，由青州市利民农化有限公司实验室分离并保存。

1.3 供试大姜品种

生姜品种“山农一号”，购自潍坊寒亭朱里镇农资。

1.4 培养基及试剂

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、PDA 培养基、孟加拉红培养基、燕麦琼脂培养基、查氏酵母膏琼脂，具体配制参照《微生物学实验》[8]。

1.5 所需仪器

SGSP-02 水隔式恒温培养箱，湖北黄石医疗器械厂；HQL300B 柜式恒温冷冻摇床，武汉中科仪技术发展有限责任公司；日立CR21G 高速冷冻离心机，日本日立公司；SHS-2 电热恒温水浴锅，湖北黄石医疗器械厂；722 型可见分光光度计，上海奥谱勒仪器有限公司；超净工作台，上海博讯实业有限公司；PCR仪，Eppendorf 公司；YX-280A 手提式不锈钢蒸汽消毒器，上海三申医疗器械有限公司；HP250GS 智能人工气候箱，武汉瑞华仪器设备有限公司。

2 实验方法

2.1 土样的采集

通过五点取样法对青州东夏镇及周边生姜种植区内的土样进行采集，选取地面以下 10 cm-15cm 处深的土壤，每点取40g土样，用无菌自封袋装好并进行编号，存置于4℃冰箱中保存，备用。

2.2 拮抗菌株的初筛

2.2.1 土壤微生物的分离

取土壤样品10g，置于装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，轻轻加入10颗小玻璃珠，先静置20min，然后在150r/min的摇床上震荡30min，制成土壤菌悬液。

吸取土壤菌悬液1mL，放入装有9mL无菌水的试管中，在漩涡震荡仪上混匀震荡，继续10倍梯度稀释，选择3个合适的稀释度，从稀释液中吸取0.1mL，加入牛肉膏蛋白胨培养基、R2A培养基中涂布均匀，每个稀释度做2个平行，30℃恒温培养3-4d。

在超净工作台中，采用分区划线分离法对平板中长出的单菌落进行分离纯化，37℃恒温培养48h。纯化好的纯种菌株可制备成30%甘油管，-80℃冷冻保存备用。

2.2.2 拮抗菌株的初筛

以模式病原菌为耙标真菌，将所制备的细菌进行液体活化，取处于对数生长期(OD600=0.5-0.6)的发酵液，与融化后的固体PDA培养基以1:5(体积比)进行混合，制备成固体初筛平板培养基。

用直径为8mm的打孔器将群结腐霉模式病原菌的菌饼接入固体初筛平板培养基的中心位置，28℃恒温培养5d后，检测抑菌效果。利用以下公式计算抑制率大小，并以抑菌圈、抑菌率及初筛菌株菌落扩散生长情况作为初筛依据。抑菌半径大于1.5cm的菌株对指示菌的生长与繁殖具有较显著抑制作用[9]。试验重复3次，设置对照。

2.3 拮抗菌株复筛

2.3.1 对筛选到能分泌IAA的细菌进行分泌量测定试验

将初筛菌株进行活化后，接入含有L-色氨酸(100mg/L)的液体牛肉膏蛋白胨培养基的试管(装液量为5ml)中，于30℃、180r/min摇床中恒温培养24h。取活化后菌悬液200μL，分别加入到96孔酶标板中，以加入200μL菌悬液到无菌牛肉膏液体培养基中为对照，通过酶标仪测定菌悬液OD600nm值，记录数据。每个待测菌株做3个平行。

取菌悬液1mL加入1.5mL离心管，10000r/min离心10min，吸100μL上清液加入到96孔酶标板，同时每孔加入100μL吲哚乙酸比色液，室温避光静置30min，取出后立即通过酶标仪测定OD530nm值。

对照加入100μL牛肉膏液体培养基和100μL吲哚乙酸比色液。

2.3.2 绘制IAA标准曲线

吲哚乙酸标准液：将0.5mol/L的FeCl3与35%的HClO4，以1:50的体积比混匀，用来配制不同浓度梯度IAA(分析纯)比色液。

配制IAA的浓度梯度为0，25，50，75，100，125，150，175，200mg/L，分别吸取100μL加入到96孔酶标板，并加入等体积吲哚乙酸比色液，避光静置30min，取出立即测定其OD530nm值。根据数据绘制标准曲线(图1)。

图1 IAA标准曲线图

2.4 拮抗菌株的鉴定

2.4.1 细菌菌株的生理生化鉴定

细菌菌株的生理生化鉴定参照《伯杰氏系统细菌学手册》第9版。

2.4.2 霉菌鉴定

霉菌菌株的鉴定主要以菌落和形态学特征为主，以真菌分类工具书[10]为依据，观察菌株生长过程中菌落的形状、颜色、生长速度、平板正反面差异、菌落边缘和表面质地、气味、菌丝高矮粗细、孢子颜色等。

菌落特征的观察：待测菌株接种到PDA培养基上，37℃培养，观察菌株整个生长过程中生长的速度、菌落的颜色、形态以及正反面的差别等。

水浸片形态观察：在载玻片上滴加一滴蒸馏水，用解剖针从生长有霉菌的平板中挑取少量带孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，蒸馏水清洗，然后放入载玻片的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片(勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片)，先用低倍镜，必要时转换高倍镜镜检并记录观察结果。

3 结果与分析

3.1 拮抗菌株的筛选

3.1.1 生长势筛选

对分离得到的312株菌株的生长能力进行筛选，其中生长势(菌落大小、培养时间)比较好的菌株102株，准备进行拮抗菌初筛试验。

3.1.2 拮抗菌株的初筛

对分离得到的102株菌株以抑菌率及抑菌半径为指标进行初筛，发酵液平均抑菌率如下表1所示，得到拮抗效果较好的菌株20株。

表1 筛选菌株的抑菌率%和抑菌半径/cm

3.1.3 拮抗菌株的复筛

将初筛得到的20种菌株，进行IAA分泌量测定，取3个平行的平均值，带入标准曲线的回归方程，计算单位体积菌悬液中IAA的含量。

结果表明，20株细菌的IAA分泌量有效区间为0.37～62.88 mg/L，其中有6株菌(30%)IAA分泌量大于30mg/L；有10株菌(50%)IAA分泌量在0.37～30mg/L之间，有4株菌(20%)IAA分泌量较小，不在正常计算值范围内。以模式菌株枯草芽孢杆菌作为阳性对照，有5株菌IAA分泌量高于阳性对照菌

株(35.24±4.23mg/L)。具体结果见表2。

表2 菌株IAA分泌量mg/L

3.2 菌株间拮抗性

将复筛得到的5株菌，进行菌株间拮抗试验，发现MS8、M1间有拮抗性，最后选取抑菌率较高的3株菌得复合菌剂，即细菌B4、B26，霉菌M67。

3.3 细菌系统发育分析

将菌株B4和B26的16S rDNA扩增产物经纯化、测序后，提交至NCBI Genebank ，获得B4和B26的序列号分别为JQ796652和JQ796651。基因序列与Genebank的核酸序列进行同源性比对 (Blast) ，结果显示，菌株B4和B26分别同Bacillustequilensis(HQ223107)和Bacillussubtilis(CJ2JN972432) 的相似性达到99%。使用软件mega4.0以Neighbor-Joining法构建系统发育树，初步鉴定菌株B4和B26为龙舌兰芽孢杆菌(Bacillustequilensis)和枯草芽胞杆菌 (Bacillussubtilis) ，如图2所示。

图2 基于16S rDNA序列的系统发育树

3.4 细菌菌株的生理生化鉴定

菌株B4和B26均在LB固体培养基上生长，两者的细胞形态及部分生理生化实验结果如表3所示。根据生理生化结果及细菌系统发育分析，初步确定菌株B4为龙舌兰芽孢杆菌(Bacillustequilensis)、B26为枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)。

表3 菌株B4和B26形态学特征和生理生化特点

对真菌(M67)进行形态学和水浸片观察，两株菌在PDA上生长，37℃恒温培养4-7天，发现菌落在PDA平板上蔓延迅速，菌丝初为白色，后变成鲜黄色，最后变为黑色绒状，菌落中有放射性褶皱，培养基背面无色或略带黄色；孢子形态为顶囊大球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色，平滑。分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌丝细胞(足细胞)上垂直生出；分生孢子头状如“菊花”(图3)。根据两株菌的形态特征和水浸片观察，以《真菌鉴定手册》和《真菌的形态和分类》为依据进行鉴定，初步确定M67为黑曲霉(Aspergillusniger)。

3.5 霉菌鉴定

图3 M67的菌落及显微镜下菌丝体与孢子形态

4 结论与讨论

以茎基腐病模式菌株为靶菌，将青州东夏镇生姜种植区田间土壤、自然堆体、朽木等采集的样品利用发酵液平板进行初筛，筛选到抑菌效果较好的菌株20株，以IAA分泌量进行复筛，获得促生效果较好的菌株5株，其中细菌4株，霉菌1株。对这5株菌进行拮抗性实验，并根据各菌株抑菌率的高低排序，最后得到抑菌能力较强的3株菌，即细菌B4、B26，霉菌M67。生理生化实验及利用16S rDNA构建进化树可知，B4为龙舌兰芽孢杆菌(Bacillustequilensis)、B26为枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis) 。根据菌落形态及显微镜下菌丝体及孢子形态特征，初步鉴定M67为黑曲霉(Aspergillusniger)。

芽孢杆菌属(Bacillusspp.)是植物根际土壤中较为普遍的微生物类群，其中的很多种类可通过分泌抗菌物质、促进植物生长、诱导植物的系统抗病性等机制实现抗病促生作用[11]。研究筛选的芽孢杆菌和黑曲霉对生姜茎基腐病病原菌群结腐霉有明显的拮抗作用，下一步将制备复合微生物菌剂进行生物防治，为生姜茎基腐病的生物防治提供理论依据与实践指导。

但复合微生物菌剂的抑菌机理目前还不明确，需要进一步研究。