基于网络药理学和分子对接技术探讨如意金黄散抗炎作用的分子机制Δ

许 坤，张洁帆，王用玉，马 威，吴玉云，陈 博，曹月龙，赵咏芳，詹红生，庞 坚#

(1.上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心，上海 200120； 2.上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海 200120)

如意金黄散首见载于明代著名医家陈实功所编著的《外科正宗》：“如意金黄散大黄，姜黄黄柏芷陈苍，南星厚朴天花粉，敷之百肿自当安。”所谓“百肿”，《外科正宗》释为“痈疽发背、诸般疔肿、跌扑损伤、湿痰流毒、大头时肿、漆疮火丹、风热天泡、肌肤赤肿、干湿脚气、妇女乳痈、小儿丹毒，凡外科一切诸般顽恶肿毒”。陈实功又谓之“凡外科一切诸般顽恶肿毒，随手用之，无不应效，诚为疮家良便方也”，以其效验。清代吴谦将如意金黄散收入《医宗金鉴》。现代研究结果显示，如意金黄散作为外用制剂被广泛应用于静脉炎、网状淋巴管炎、痛风性关节炎、急性乳腺炎、阑尾周围脓肿、流行性腮腺炎、肱骨外上髁炎、膝骨关节炎和类风湿关节炎等感染与非感染性炎症疾病，可见其局部外用抗炎与抗感染的效用得到了临床医师的广泛肯定。然而，关于如意金黄散的效应机制与有效成分研究却鲜见于报道，限制了其组方配伍优化与制剂的改进。既往药理学研究结果显示，如意金黄散中的大黄[1]、黄柏[2]、姜黄[3]和白芷[4]等多种药物均具有抗炎作用。但是，由于如意金黄散组方中所含药味多样、成分复杂，作为外用制剂又涉及药物透皮吸收的生物利用度等问题，使得基于传统药理学研究思路的研究开展颇多局限。

2007年，Hopkins[5]率先提出并系统地阐述了网络药理学的概念，将药物作用网络与机体生物网络结合在一起，分析药物在网络中与特定节点或模块的相互作用关系，从而理解药物与机体的相互关系。近年来，采用网络药理学的方法来进行中医病症的分析以及中药药理的机制探讨已成为中医药研究的重要方法[6]。本研究尝试采用网络药理学方法与生物信息学技术，运用多个网络数据库和数据分析软件等研究工具，从分子层面探讨如意金黄散抗炎作用的活性成分与潜在机制，为后续的药理与制剂研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 筛选炎症的疾病靶点

运用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)[7]，以“inflammation”为关键词，搜索与炎症相关的疾病靶点基因，并将数据导出，并以“相关性分数[8]>5”为筛选条件进行筛选，筛选时间范围为自建库至2021年12月20日。

1.2 筛选如意金黄散的成分及靶点

在BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)[9]中分别检索大黄、黄柏、姜黄、白芷、天南星、陈皮、苍术、厚朴、甘草和天花粉，筛选如意金黄散中药物的活性成分及其相对应的靶点，筛选标准为score cutoff≥30且P<0.05，筛选时间范围为自建库至2021年12月20日。

1.3 获取“炎症-如意金黄散”交集基因

运用R软件(v4.0.0)，将“1.1”中筛选出的炎症相关疾病的靶点基因与“1.2”中筛选出的如意金黄散相关靶点基因取交集，并绘制出韦恩图。

1.4 绘制“药物-成分-靶点”网络图

运用perl软件(v5.28.1)，将如意金黄散靶点基因与“炎症-如意金黄散”交集靶点基因一一映射，再用Cytoscape软件(v3.7.0)将相关数据进行可视化处理，绘制出“药物-成分-靶点”调控网络图。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络并筛选核心靶点基因

将“1.3”中获取的“炎症-如意金黄散”交集基因导入String在线软件(https://string-db.org/，v11.0)，Organism选项设置为“Homo sapiens”，将最小互作得分设置为0.6，绘制出PPI网络图。从String在线软件获得的数据中，筛选出连接节点最多的30个基因，并绘制出条形图。

1.6 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

为了进一步明确如意金黄散抗炎的作用机制，运用R软件将“炎症-如意金黄散”交集基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并绘制出相关柱状图和气泡图，P<0.05为差异有统计学意义。

1.7 分子对接验证

在“1.4”获得的“药物-成分-靶点”调控网络图中，筛选与靶蛋白连接节点最多的10个主要活性成分，从中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中找出这10个主要活性成分的3D结构，并保存为mol2格式；筛选出连接节点排序居前10位的靶蛋白，从PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中找出这10个靶蛋白的3D结构，并保存为PDB格式。运用AutoDock软件(v1.5.6)将活性成分及靶蛋白转换成pdbqt格式，最后使用Vina将10个活性成分与10个靶基因一一进行对接。

2 结果

2.1 筛选炎症的疾病靶点

运用GeenCard数据库搜索出炎症相关的疾病靶点基因9 921个，以“相关性分数>5”为筛选条件进行筛选后获得1 648个炎症相关疾病靶点基因。

2.2 筛选如意金黄散的成分及靶点，获取“炎症-如意金黄散”交集基因

通过BATMAN-TCM数据库检索筛选，共得到283种如意金黄散的活性成分，共涉及793个相关靶点，见表1；将其与1 648个炎症相关疾病靶点取交集，结果显示共有159个“炎症-如意金黄散”交集靶点基因，见图1。如意金黄散主要活性成分见表2。

表1 如意金黄散成分靶点数量Tab 1 Target quantity of Ruyi Jinhuang powder

图1 如意金黄散-炎症交集靶基因Fig 1 Intersection target genes of Ruyi Jinhuang powder-inflammation

表2 如意金黄散主要活性成分Tab 2 Main active components of Ruyi Jinhuang powder

2.3 绘制“药物-成分-靶点”网络图

运用Cytoscape软件将相关数据进行可视化处理，绘制出“药物-成分-靶点”调控网络图，见图2。图中，菱形表示如意金黄散中所含的中药名称，圆形表示如意金黄散中所含的中药活性成分，长方形表示“炎症-如意金黄散”交集靶点基因。图中显示，如意金黄散主要通过217个药物活性成分作用于159个靶点，从而发挥抗炎作用。

图3 炎症-如意金黄散交集靶点基因PPI网络图Fig 3 PPI network of target genes at the intersection of inflammation-Ruyi Jinhuang powder

2.4 构建PPI网络并筛选核心靶点基因

通过String在线软件构建出“炎症-如意金黄散”交集靶点基因的PPI网络，见图3。图中共有149个节点(隐藏10个游离节点)，862条相互作用关系。将连接次数最多的30个靶点基因筛选出来，绘制出条形图，见图4。

图4 核心靶基因条形图Fig 4 Core target gene bar chart

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

将如意金黄散治疗炎症的核心靶点基因运用R软件进行GO功能富集分析，得到GO条目2 051个(P<0.05)，其中涉及生物过程(BP)的条目1 844个，占89.9%；涉及细胞组成(CC)的条目78个，占3.8%；涉及分子功能(MF)的条目129个，占6.3%。各排序居前20位的条目见图5。

A.BP；B.CC；C.MFA.BP；B.CC；C.MF图5 GO功能富集分析Fig 5 Go enrichment analysis

进行KEGG通路富集分析共得到145条(P<0.05)信号通路，主要包括流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、神经活性配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物(AGE)-RAGE受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等。选择富集基因最多的前20个信号通路绘制气泡图，见图6；并绘制出靶点-通路网络图，见图7。

图6 KEGG通路富集分析Fig 6 KEGG enrichment analysis

图7 靶点-通路网络图Fig 7 Target-pathway network

2.6 分子对接验证

将与靶基因连接节点最多的10个主要活性成分和连接节点排序居前10位的靶蛋白进行分子对接，结果见表3、图8。部分分子对接效果图见图9。一般认为，受体与配体直接的结合能越低，则两者结合的稳定性越高。当结合能≤-20.920 0 kJ/mol时，说明受体和配体可以自由结合；当结合能≤-29.288 0 kJ/mol时，说明受体和配体结合后有较强的稳定性。本次分子对接结果显示，结合能≤-29.288 0 kJ/mol的占20%，结合能≤-20.920 0 kJ/mol的占86%，表明本次网络药理学研究结果具有一定的可靠性。

表3 分子对接结果(kJ/mol)Tab 3 Molecular docking results (kJ/mol)

图8 分子对接评分热力图Fig 8 Thermodynamic diagram of molecular docking score

A.黄体酮-NR3C1；B.黄体酮-TP0；C.去氢二酮-ESR1A. progestin-NR3C1; B. progestin-TP0; C. dehydrodione-ESR1图9 部分分子对接效果图Fig 9 Effect of partial molecular docking

3 讨论

既往已有众多学者通过网络药理学等方法对中药治疗各种疾病的机制进行了探究，但研究对象绝大多数为内服药物。中医外用药物在临床应用广泛且取得了较好的疗效[10]，但对其药效机制的研究报道却并不多见。究其原因，可能与相关中药数据库中的筛选方式有关，如在TCMSP数据库中，人们常用于筛选中药成分的指标口服生物利用度只适用于筛选口服中药，而不适用于筛选外用中药。因此，建议进行外用药物的网络药理学分析时，可选用BATMAN-TCM或TCMID等数据库进行成分筛选。

中医学认为，炎症反应的过程即为正邪斗争的过程[11]。持续的炎症反应在不同程度上影响着人们的生活质量。中医药通过扶正祛邪的方式治疗炎症已有悠久历史，有着成本低、疗效佳、不良反应小和不易产生耐药性等优点，且注重辨证论治和整体观念，可在消除局部炎症的同时调节全身的免疫状况[12]。

本研究结果提示，香芹酮、黄体酮、姜黄酮、反式苯亚甲基丙酮、10-十一烯酸、去氢莪术二酮和香叶基丙酮等化合物可能是如意金黄散抗炎作用的主要活性成分。“炎症-如意金黄散”交集靶点基因的PPI关系显示，INS、蛋白激酶B(Akt1)、白蛋白(ALB)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1和肿瘤坏死因子(TNF)等是如意金黄散发挥抗炎作用的核心靶点基因。有研究结果表明，患者在遭受重症创伤的同时，常会产生应激性高血糖，从而加大感染的风险，INS可以通过调控血糖水平来抑制炎症反应从而降低感染概率[13]。李坤等[14]通过动物实验研究发现，上调Akt1的表达水平，可以下调TNF-α、白细胞介素6等炎症因子的表达。MAPK1是丝裂原活化蛋白激酶中的一种，与细胞分化、凋亡和炎症密切相关。

研究结果发现，如意金黄散抗炎机制的相关通路主要涉及流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、环磷酸腺苷信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路破骨细胞分化信号通路、雌激素信号通路和TNF信号通路等。(1)流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路：动脉粥样硬化为常见的慢性疾病，其发病具有与炎症相似的变质、渗出及增生等特点，抗炎也已成为治疗动脉粥样硬化疾病的新思路[15-16]。(2)神经活性配体-受体相互作用信号通路：研究结果表明，神经系统对炎症反应的调控具有重要作用，交感神经的过度激活会加重炎症反应，而副交感神经可以通过降低肿瘤坏死因子受体1的表达，进而发挥抗炎作用[17]。(3)雌激素信号通路：雌激素的作用具有多效性，影响着机体内多个系统。有文献报道，雌激素的急性丢失会增加活性氧的水平，并激活核因子κβ和促炎细胞因子的产生，表明雌激素具有明显的抗炎特性[18]。(4)环磷酸腺苷信号通路：环磷酸腺苷是稳定内皮细胞屏障的最有效的信号分子之一，环磷酸腺苷的刺激可以有效阻断大多数炎症介质所致内皮细胞通透性增加[19]。(5)糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和TNF信号通路：Tang等[20]的研究结果发现，高水平的TNF-α显著促进了2型糖尿病患者机体内的慢性炎症，该过程可能由糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和TNF信号通路等多个通路完成，而TNF-α下调的分子机制有待进一步研究。

综上所述，如意金黄散可能是通过香芹酮、黄体酮和姜黄酮等多种酮类活性成分参与流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路、雌激素信号通路和TNF信号通路等多个途径作用于INS、Akt1、ALB、MAPK1和TNF等多个靶点，从而发挥抗炎作用，且运用分子对接技术对关键靶点进行验证，提示黄体酮和去氢莪术二酮与关键抗炎靶点能够最佳结合。本研究基于网络药理学方法对如意金黄散抗炎作用的分子机制进行探究，为后续中医外用药的推广和应用提供了新思路和新方向。由于药物制剂的调配差异以及网络数据库和软件算法的不足，使得本研究结果有着一定的局限性，为取得更加详实可靠的研究数据，还需通过基础或临床试验进一步验证。