芪骨胶囊高效液相指纹图谱研究

阳丽华 肖惠琳 何迎庆 车莉 张建忠

（1. 厦门中药厂有限公司 厦门 361100；2. 上海医药集团股份有限公司 上海 200020）

芪骨胶囊由淫羊藿、制何首乌、黄芪、石斛、肉苁蓉、骨碎补、菊花组成，具有滋养肝肾，强筋健骨的功效。用于女性绝经后骨质疏松症肝肾不足证，症见腰膝酸软无力、腰背疼痛、步履艰难、不能持重[1-2]。目前芪骨胶囊产品质量控制方法中没有指纹图谱技术，而中药指纹图谱技术具有信息量大，特征性强，可同时反映中药复杂混合体系中各种化学成分的整体情况，较完整地反映中药材及其制剂的质量[3]。目前范兴等[4]研究的芪骨胶囊指纹图谱指认出5个化合物，为了指认出尽可能多的活性化学成分及控制尽可能多的处方药味的质量，我们进一步深入研究了芪骨胶囊指纹图谱，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（沃特世有限公司）；ME1002E电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；KQ-600DE数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

松果菊苷（批号111670-201706，含量89.7%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201606，含量97.6%）、柚皮苷（批号110722-201815，含量91.7%）、淫羊藿苷（批号110737-201516，含量94.2%）、朝藿定C（批号111780-201804，含量92.6%）、大黄素（批号110756-201512，含量98.7%）均购自中国食品药品检定研究院；2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷（批号must-18051611，含量99.44%）、朝藿定B（批号must-18071403，含量99.23%）、朝藿定A（批号must-18072304，含量98.13%）、淫羊藿次苷Ⅰ（批号must-18102120，含量97.78%）、宝藿苷Ⅰ（批号must-18042203，含量99.58%）购自成都曼思特生物科技有限公司；芪骨胶囊来自厦门中药厂有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯；水为纯化水；其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流速1 mL/min；检测波长270 nm；进样量10 μL；流动相[4]为甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液，进行梯度洗脱（表1）。

表1 流动相梯度洗脱

1.3.2 溶液的制备

1）供试品溶液 精密称量芪骨胶囊内容物0.5 g加入50 mL甲醇，称定重量；超声30 min，用甲醇补足减失的质量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液进样分析[4]。

2）对照品溶液 取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL中含松果菊苷18.55 μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷25.22 μg、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷30.95 μg、柚皮苷 26.89 μg、朝藿定 A 25.75 μg、淫羊藿苷18.92 μg、朝藿定 B 20.00 μg、淫羊藿次苷Ⅰ 26.60 μg、朝藿定 C 22.48 μg、大黄素 16.07 μg、宝藿苷Ⅰ 22.70 μg的对照品溶液。

2 结果

2.1 专属性考察

分别取空白溶剂和芪骨胶囊供试品溶液进行HPLC分析，结果表明，空白溶剂（甲醇）对供试品溶液的分析不存在干扰，专属性良好（图1）。

图1 专属性考察用HPLC分析

2.2 精密度试验

吸取供试品溶液进样6次分析，以淫羊藿苷的峰面积和保留时间为参照，计算15个共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果显示，15个共有峰的相对峰面积的RSD在0.09%～2.29%之间，相对保留时间的RSD在0.01%～0.09%之间，表明仪器的精密度良好。

2.3 稳定性试验

取供试品溶液分别于室温放置0、2、4、6、10、16、24、36、48、72 h时进样分析，以淫羊藿苷的峰面积和保留时间为参照，计算15个共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果显示，15个共有峰的相对峰面积的RSD在0.49%～3.18%之间，相对保留时间的RSD在0.01%～0.62%之间，表明供试品在72 h内基本稳定。

2.4 重复性试验

取同一批芪骨胶囊粉制备6份芪骨胶囊供试品溶液，进样分析，以淫羊藿苷的峰面积和保留时间为参照，记录15个共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果显示，15个共有峰的相对峰面积的RSD在0.20%～2.95%之间，相对保留时间的RSD在0.01%～1.15%之间，表明实验的重现性良好。

2.5 HPLC指纹图谱的建立与相似度、共有峰分析

取21批芪骨胶囊粉末进样和分析，运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）进行21批样品HPLC图谱分析，得HPLC指纹图谱（图2、3）。

图2 21批样品的HPLC叠加指纹图谱

2.6 相似度评价

运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以对照指纹图谱进行对照，对整体相似度进行评价。各样品图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.9，表明21批样品质量稳定性良好。

图3 样品的HPLC对照指纹图谱

2.7 共有峰的指认

通过与各味药材、阴性样品色谱图比对，对15个共有色谱峰进行指认，共指认了14个峰的药味归属[4-10]，其中峰7、8、9、10、11、12、13、14归属淫羊藿；峰4、15归属何首乌；峰5、6归属骨碎补；峰3归属黄芪；峰2归属肉苁蓉。与混合对照品色谱图比对，指认出了11个峰的化学成分，峰2为松果菊苷、峰3为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、峰4为2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷、峰6为柚皮苷、峰7为朝藿定A、峰8为朝藿定B、峰9为朝藿定C、峰10为淫羊藿苷、峰11为淫羊藿次苷1、峰14为宝藿苷1、峰15为大黄素。

3 讨论

通过大量实验，对流动相组成和流动相洗脱条件的优化研究，最终优选出液相色谱条件，在该技术条件下所建立的指纹图谱能同时检测出芪骨胶囊的11个化学成分，比范兴等建立的芪骨胶囊HPLC指纹图谱可多指认出6个化学成分，加严了产品的质量控制。另外对15个峰进行了药味归属，可提升产品的质量控制水平。

本研究建立的芪骨胶囊指纹图谱检测方法，其专属性、精密度、稳定性、重复性考察结果均符合要求，具有较好的可行性。后期将继续收集大量批次的芪骨胶囊样品来验证所建立的对照指纹图谱的合理性，对其不断完善，为产品质量评价提供更加全面的理论依据。