绿茶中三唑磷和茚虫威农药残留的不确定度评定

林 涛，郭 瑾，李梦霞，林 昕，陈 静，李茂萱，李彦刚，刘宏程*

1. 云南省农业科学院 质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650205；2. 云南工商管理学院 医学院，云南 昆明 650106；3. 云南省农业科学院 茶叶研究所，云南 昆明 650205

三唑磷和茚虫威是茶树种植过程中普遍使用的农药，主要用于防治茶树丽绿刺蛾、茶小绿叶蝉和螨虫等害虫[1-3]。近年来，随着茶树虫害的日益严重，三唑磷和茚虫威在茶树上的用量也不断增大，导致茶叶中的残留量较大[4-5]。在饮用茶叶时，三唑磷和茚虫威都会在一定程度上随着茶叶冲泡过程而迁移到茶汤中并进入到人体内[6-7]，过量的摄入必然会对人体造成一定的伤害。基于此，我国的食品中农药最大残留限量标准（GB 2763—2021）[5]对于茚虫威在茶叶中制定了最大残留限量要求；虽然没有对三唑磷进行最大残留限量规定，但对于三唑磷的每日允许摄入量（ADI）也规定了较低的允许值。

为了监测绿茶中的三唑磷和茚虫威残留量，我国的GB 2763—2021以及相关的文献也报道了关于三唑磷和茚虫威的测定方法[8-10]，但是由于绿茶基质成分复杂，在测定过程中常常会出现杂质干扰以及较强的基质效应，严重地影响了两种农药的准确定量[11-12]，这对于绿茶中三唑磷和茚虫威的残留监测带来了较大的困难。

近年来，基体标准物质的出现能够有效地提高分析过程中的检测质量，确保检测方法及数据的可靠性、准确性和可溯源性[13]，但是目前在茶叶中农药残留的基体标准物质还比较少，仅有的主要包括了啶虫脒基体标准样品[14]、联苯菊酯基体标准样品[15]、嘧霉胺等13种农药多残留基质标准样品[16]，对于三唑磷和茚虫威等农药的基体标准物质的研究还处于空白。基于此，本试验研究针对绿茶种植过程中用量较大、检出率较高的三唑磷和茚虫威进行基体标准物质的研制，以期为茶叶中农药残留检测与质量安全监管提供标准物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶树（小叶种），云南省普洱市；正己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲醇（色谱纯），德国Merck公司；乙酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、柠檬酸二钠盐倍半水合物、柠檬酸钠二水合物（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；甲酸、乙酸、乙酸铵（色谱纯），中国迪马科技公司；ENVI-Carb SPE固相萃取小柱（6 mL，250 mg），美国 Supelco公司；陶瓷均 质 子、ProElut C18、PSA、GCB 填 料（50µm），中国迪科马科技公司；三唑磷标准物质（100 μg/mL，GBW(E)082281），坛墨质检科技股份有限公司；茚虫威标准物质（10 μg/mL，L14325500CY），Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；三唑磷原药（PD20050119，有效成分含量85%），安道麦股份有限公司；茚虫威原药（PD20170278，有效成分含量97%），江苏建农植物保护有限公司。

API4000三重四极杆串联质谱仪，美国AB Sciex公司；1290超高效液相色谱仪，美国Agilent公司；ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（1.7 µm, 1 mm × 50 mm），美国 Waters公司；7890B气相色谱仪（配ECD检测器），美国安捷伦公司；XSR225DU/AC电子天平，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；TGL-15B型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；涡旋振荡器，美国Thermo Scientific公司；HY-5型回旋式振荡仪，江苏省金坛市环宇科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 绿茶中三唑磷、茚虫威阳性基质样品的制备

在云南省普洱地区的茶园，选取长势健康、无明显病虫害的适龄茶树25棵，将三唑磷和茚虫威原药用水稀释为1 mg/L的浓度，混匀后喷施2次，喷施时间分别为采收前20 d和前10 d，其他栽种条件不变。待茶叶到采摘期时分别从每棵茶树上采摘适量鲜叶，混匀后取5 kg，参照GB/T 14456.1—2017[17]中的加工工艺进行绿茶的制作，制作好的绿茶样品粉碎过80目分子筛后混匀待分装。

1.2.2 绿茶中三唑磷、茚虫威基体标准物质的分装

将以上粉碎混匀后的绿茶样品装入50 mL的HDPE塑料小瓶，每瓶分装重量为10 g，共分装150瓶，密封后于室温下避光保存。

1.2.3 绿茶中三唑磷、茚虫威基体标准物质的均匀性检验

随机抽取分装好的基体标样10瓶，每瓶平行称取 3 份，每份 2 g，采用 GB 23200.121—2021[18]中规定的对茶叶的测定方法分别对三唑磷和茚虫威2种农药进行测定。测定结果参照GB/T 15000.3—2008（标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法）[19]，以F检验，确定绿茶样品的均匀性数据是否符合正态分布。

1.2.4 绿茶中三唑磷、茚虫威基体标准物质的稳定性检验

短期稳定性考察。模拟运输条件包括常规和极端的运输条件，分别考察4℃、20℃和40℃下的稳定性，分别在第 0 d、3 d、5 d、7 d、14 d进行稳定性考察，每个考察样品测定5次，取5次结果的平均值，根据GB/T 15000.3—2008[19]采用t-检验对检测结果进行统计分析，相关计算公式如下：

在自由度n-2、置信水平p=0.95（95%显著水平）下，t- 检验的临界值为：t(0.95,n-2)=t(0.95,3)=3.182；如果 ＜ t(0.95,n-2)s(b1)，则斜率并不显著，表明检测样品在相应的考察周期内稳定性较好，反之则说明稳定性较差。

短期稳定性的不确定度的贡献

长期稳定性考察。分别于第0个月、1个月、3个月、6个月、12个月取样检测。每次取2瓶样品，每个样品称取3份平行样品，每份试样以测定5次的平均值为其定值结果。根据GB/T 15000.3—2008[19]，采用t-检验进行统计分析，相关的斜率计算公式、截距计算公式、直线上每点的标准偏差计算公式、与斜率相关的不确定度计算公式以及长期稳定性的判断与短期稳定性的计算公式相同。长期稳定性的不确定度的贡献ults=12s(b1)。

1.2.5 绿茶中三唑磷、茚虫威基体标准物质的定值

两种不同原理测定方法的比较。三唑磷的两种不同原理测定方法分别采用GB 23200.113—2018[20]和 GB 23200.121—2021[18]并对测定结果进行比较。茚虫威的两种不同原理测定方法分别采用SN/T 1971—2007（第一法，气相色谱法）[21]和GB 23200.121—2021[18]并对测定结果进行比较。

多家实验室联合定值。分别选取质检行业、农业检测行业、科研机构等不同行业的代表性相关检测机构8家，随机从分装好的基体标样中抽取样品24瓶，每个实验室分发3瓶，每瓶称取1份样品，按照GB 23200.121—2021[18]方法进行测定，平行测定2次。参照GB/T 15000.3—2008[19]，相关计算公式如下所示。

2 结果与分析

2.1 均匀性

均匀性检验结果分别见表1 ～ 表4。从表2和表4可知，三唑磷和茚虫威的MS间/MS内都小于F0.05（9, 20），说明此次制备的绿茶中三唑磷和茚虫威基体标准物质的均匀性较好。

表1 绿茶中三唑磷均匀性检验的测量数据Table 1 Measurement data of triazophos homogeneity test in green tea

表2 绿茶中三唑磷均匀性研究的方差分析表Table 2 Analysis of variance table for the study on the homogeneity of triazophos in green tea

表4 绿茶中茚虫威均匀性研究的方差分析表Table 4 Analysis of variance table for the study on the homogeneity of indoxacarb in green tea

从上表可见，以υ1（即组间）=9及υ2（即组内）=20查 F 界值表，得 F0.05(9, 20)=2.39，由于 F=MS间/MS内=0.615008473 ＜ F0.05（9, 20），所以本样品是均匀的。

表3 绿茶中茚虫威均匀性检验的测量数据Table 3 Measurement data of indoxacarb homogeneity test in green tea

均匀性检验的不确定度ubb=sbb=0.004。

从上表可见，以υ1（即组间）=9及υ2（即组内）=20查F界值表，得F0.05(9, 20)=2.39，由于F= MS间/MS内= 1.879 ＜ F0.05（9, 20），所以本样品是均匀的。

2.2 稳定性

2.2.1 短期稳定性

用t-检验对数据进行统计分析，试验结果见表 5。三唑磷和茚虫威的都小于 t(0.95,nμ2)s(b1)，说明斜率不显著，表明此绿茶中三唑磷和茚虫威基体标准样品的短期稳定性较好。

表5 短期稳定性检验试验结果Table 5 Short-term stability test results

2.2.2 长期稳定性

用t-检验对数据进行统计分析，试验结果见表 6。三唑磷和茚虫威的都小于 t(0.95,nμ2)s(b1)，说明斜率不显著，表明此绿茶基体标准样品在12个月内稳定性较好。

表6 稳定性检验试验结果Table 6 Test Results of stability check

2.3 定值结果

2.3.1 不同原理方法的测定结果比较

根据相关的国家标准中对于三唑磷和茚虫威的测定方法，不同测定方法的结果如表7所示。结果表明，不同原理的测定方法对于绿茶中的三唑磷和茚虫威的相对相差较小，标准中的相关方法都可以使用，但为了在实际检测工作中快速便捷，推荐该基体标准物质中的三唑磷和茚虫威采用GB 23200.121—2021中的LC-MS/MS方法进行测定。

表7 两种测定方法比较Table 7 Comparison of the two determination methods

2.3.2 定值结果

三唑磷和茚虫威的多家实验室联合定值结果及相关计算分别见表8和表9。

表8 三唑磷联合定值结果Table 8 Results of joint determination of triazophos

表9 茚虫威联合定值结果Table 9 Results of joint determination of indoxacarb

2.3.3 不确定度计算

根据GB/T 15000.3—2008的规定，定值结果由特性值和不确定度组成。根据本次绿茶中三唑磷和茚虫威基体标准物质的研制过程，其不确定度uCRM由标准值定值试验产生的不确定度天平称量产生的不确定度u1（使用的电子天平分辨率为0.00001 g，它的最大允许误差为0.00010 g，按均匀分布，故仪器产生的不确定度、均匀性检验的不确定度ubb、短期稳定性检验的不确定度usts和长期稳定性检验的不确定度ults组成，如表10所示。

表10 绿茶中三唑磷和茚虫威基体标准物质特性值Table 10 Characteristic values of matrix reference material of triazophos and indoxacarb in green tea

3 结论

本实验采用在茶树上喷洒三唑磷和茚虫威农药制备得到阳性样品，并按照绿茶加工工艺制备得到成品茶后进一步粉碎、过筛、分装后得到绿茶中三唑磷和茚虫威基体标准物质。均匀性和稳定性检验表明该基体标准物质的均匀性较好，且12个月内较稳定。通过多家实验室联合定值结果为：三唑磷0.317±0.027 mg/kg、茚虫威 0.572±0.029 mg/kg。