麦粒灸对荷瘤小鼠肿瘤组织中Bax和Bcl-2表达的影响

朱 涛，马艳竹，程艳婷△,李俊莲，李健豪

(1.山西中医药大学，山西 晋中 030600；2.郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450001)

恶性肿瘤是严重危害人们生命健康的疾病之一，中国每年死亡率高达30%，且仍有上涨趋势[1-2]。目前，环磷酰胺(CTX)仍然是治疗肿瘤的重要手段之一，课题组前期研究发现，艾灸腧穴组方“大椎”“足三里”“三阴交”穴具有改善化疗药CTX不良反应的作用[3]。麦粒灸属于艾灸疗法中直接灸的一种，以“体积小、渗透性强”著称[4]。在肿瘤治疗过程中，麦粒灸与CTX合用是否具有协同增效的作用是本实验关注的一个焦点。现代医学认为，肿瘤的发生、发展与细胞凋亡异常密切相关，而诱导细胞凋亡是抑制肿瘤生长的主要方式之一[5]。而Bax、Bcl-2是细胞凋亡家族中最经典的因子，在肿瘤细胞凋亡中扮演着重要角色[6]。基于此，本实验从肿瘤细胞凋亡相关角度，通过建立Hepa1-6荷瘤小鼠模型，观察麦粒灸荷瘤小鼠对肿瘤组织中Bax及Bcl-2表达水平，以期为艾灸抑制肿瘤提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康SPF级C57BL/6雄性小鼠40只，体质量(16±2)g，6～8周龄[由北京维通利华实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(京)2016-0006]，饲养在郑州大学第一附属医院重点实验室。所有小鼠均自由取食(予以常规饲料)和饮水，明暗周期为12/12 h，环境温度22～25℃，湿度(45±10)%，适应性喂养1周后进行实验。将小鼠按随机数字表分为对照组、麦粒灸组、CTX组与麦粒灸+CTX组，每组10只。实验过程严格遵守中华人民共和国2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》及伦理学规定。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 试剂 Hepa1-6肿瘤细胞株(由郑州云笛生物科技有限公司惠赠);注射用环磷酰胺(Baxter Oncology GmbH，生产批号:9L353A);精细艾绒(南阳宜康艾艾草制品有限公司);石蜡、无水乙醇、0.9%生理盐水注射液和HE染液(Servicebio公司，生产批号：G1005-500ML);牛血清白蛋白(Servicebio公司，生产批号：G5001-5G);BCL-2Antibody(Cusabio，生产批号：CSB-RA002611A0HU);Bax Antibody(Cusabio，生产批号：CSB-PA000976)。

1.2.2 仪器 电子天平LT1002(沈阳龙腾电子有限公司);细胞培养箱(上海力申股份有限公司);MX3000qPCR仪(德国LAICA公司);EG1160包埋机(德国LAICA公司);RM2126病理切片机(德国LAICA公司);组织切片全景扫描仪(匈牙利3DHISTECH);ImageJ图像分析软件。

1.3 植瘤方法

在参考相关文献[7]的基础上，结合本课题组前期造模方法优化改进，将复苏后的Hepa1-6肿瘤细胞株进行复苏、培养并接种于昆明种小鼠腹腔，1周后形成腹水，抽出腹水并离心，调整细胞密度为3×106/mL，抽取0.2 mL接种于C57BL/6小鼠右侧腋后皮下建立Hepa1-6荷瘤模型。接种5 d后，以肉眼可见肿块及病理检测作为植瘤成功的标准。

1.4 穴位选取及干预治疗

腧穴定位参考李忠仁主编《实验针灸学》[8]，选取“大椎”“足三里”(双侧)“三阴交”(双侧)作为施灸穴位。麦粒灸大小以及施灸方法为将小鼠固定后，对施灸穴位脱毛，艾绒制成麦粒大小(1.5g/粒)的艾炷，置于涂抹凡士林的穴位上，线香引燃，当艾炷烧至3/4时，用镊子快速取下残存艾炷，并灸下一壮，每穴时间约25～30 s[9]。

植瘤成功后，对照组给予腹腔注射生理盐水0.2 mL/d，1次/d，连续3 d；CTX组、麦粒灸+CTX组按荷瘤小鼠体质量给予腹腔注射CTX 30 mg/kg[10]，1次/d，连续3 d；麦粒灸组、麦粒灸+CTX组给予麦粒灸“足三里”(双侧)、“三阴交”(双侧)和“大椎”，每穴5壮，1次/d，连续10 d。麦粒灸组和麦粒灸+CTX组于每日同一时间行麦粒灸治疗。

末次治疗后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，剥离出肿瘤组织放入-80 ℃冰箱进行保存，待检测。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 观察各组荷瘤小鼠干预前后一般情况 包括毛色光亮度、反应灵敏度、活动程度、精神状态及体质量等。

1.5.2 检测瘤体质量及抑瘤率 将剥离出的瘤体用无菌滤纸吸干血液后称重并计算抑瘤率。公式:抑瘤率(%)=(对照组平均瘤体质量-治疗组平均瘤体质量)/对照组平均瘤体质量×100%。

1.5.3 HE染色法观察肿瘤组织病理学变化 将固定好的肿瘤组织进行脱水、常规石蜡包埋。切成约5 μm厚度的石蜡切片，滴加苏木精，染色5 min后冲洗，滴加伊红染色3 min，使用乙醇脱水，自然晾干后，二甲苯中透明10 min，中性树胶封片，置于全景扫描仪下观察肿瘤组织病理学变化。

1.5.4 实时荧光定量PCR法检测肿瘤组织Bax、Bcl-2 mRNA的表达水平 选用Trizol试剂盒提取肿瘤组织总RNA，紫外分光光度仪检测其浓度及纯度，反转录试剂盒将RNA合成cDNA。引物设计及合成均由上海生物工程股份有限公司完成，以总mRNA为模板，反转录为cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，反应在20 μL体系中进行，反应体系：1 μL qPCR引物，1 μL cDNA产物，10 μL SYBR Green qPCRMaster Mix(2×)。扩增条件：预变性95 ℃-10 min，95 ℃-15 s，60 ℃-60 s，循环40次。溶解曲线60-95 ℃，每15 s升温0.3 ℃。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法分析计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.5.5 Western blot法检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白表达水平 提取各组小鼠肿瘤组织蛋白，测定蛋白浓度。通过配胶、电泳、转膜和脱脂牛奶封闭，加入兔抗鼠lgG Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶5 000)及β-actin多克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃冰箱封闭过夜，PBS-T洗涤，加入二抗，室温2 h。PBS-T洗涤，ODYSSEY双色红外激光成像系统扫描图像入计算机。运用ImageJ软件分析处理Bax、Bcl-2条带灰度值，以Bax、Bcl-2与内参β-actin条带灰度值的比值表示其相对表达量。

表1 引物序列

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组荷瘤小鼠干预前后日常情况对比

干预前，各组荷瘤小鼠精神状态一般，活动较自如，毛色较光亮，对外界刺激反应较灵敏，饮食无异常，体质量稍有增加。干预后，对照组反应灵敏度明显下降，毛质粗涩，体质量下降幅度较小；麦粒灸组能站立行走，但步态缓慢，毛色较光亮，反应稍灵敏，体质量增长较少；CTX组对外界刺激反应迟钝,背毛耸立，步态不稳，鼠毛脱落多，体质量大幅度下降;麦粒灸+CTX组意识较清楚，反应灵敏度有所增加，部分鼠毛脱落，体质量趋于稳定，增长幅度较小。

2.2 各组小鼠瘤体质量及抑瘤率变化

与对照组比较，麦粒灸组、CTX组和麦粒灸+CTX组瘤体质量显著减轻，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，抑制率分别为23.9%、45.9%和67.1%，其中麦粒灸+CTX组抑瘤效果最好；与CTX组比较，麦粒灸+CTX组瘤体质量显著减轻，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

注：A.对照组;B.麦粒灸组;C.CTX组;D.麦粒灸+CTX组。图1 各组荷瘤小鼠瘤体图

表2 各组小鼠瘤体质量及抑瘤率比较

2.3 各组荷瘤小鼠肿瘤组织病理形态学比较

镜下见：对照组肿瘤细胞大小、形态各异，核膜核仁清晰，分裂细胞多；麦粒灸组肿瘤细胞核分裂较少，肿瘤坏死区明显增多；CTX组肿瘤细胞结构较模糊，核分裂减少；麦粒灸+CTX组肿瘤细胞排列松散，核膜、核仁模糊，核分裂显著减少。见图2。

图2 各组小鼠肿瘤组织病理形态比较(HE染色,400×)

2.4 各组小鼠肿瘤组织中Bax、Bcl-2 mRNA的表达水平比较

与对照组比较，CTX组、麦粒灸组和麦粒灸+CTX组Bax mRNA表达水平均显著升高、Bcl-2 mRNA表达水平均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；与CTX组比较，麦粒灸+CTX组Bax mRNA表达水平显著升高、Bcl-2 mRNA表达水平显著降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)。见表3和图3。

表3 各组荷瘤小鼠肿瘤组织中Bax、Bcl-2 mRNA的表达水平

2.5 各组小鼠肿瘤组织中Bax、Bcl-2蛋白表达比较

与对照组比较，CTX组、麦粒灸组和麦粒灸+CTX组Bax蛋白表达显著升高、Bcl-2蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；与CTX组比较，麦粒灸+CTX组Bax蛋白表达显著升高、Bcl-2蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)。见图4、表4。

注：A.对照组;B.麦粒灸组;C.CTX组;D.麦粒灸+CTX组。图4 各组小鼠肿瘤组织中Bax、Bcl-2蛋白条带图

表4 各组荷瘤小鼠肿瘤组织中Bax、Bcl-2蛋白表达

3 讨论

肿瘤在中医学中被归属为“癥瘕”“积聚”等范畴[11]。《灵枢·百病始生》曰：“积之始生，得寒乃生，厥乃成积矣”，《备急千金要方》引《药对》中亦言:“夫众病积聚，皆起于虚”[12]，故中医学认为肿瘤的形成与机体受寒、阳气亏虚有关。目前，以CTX为主的化疗药仍然是治疗肿瘤的重要手段之一，可通过破坏肿瘤细胞DNA或终止细胞周期抑制肿瘤的发生、发展，但其苦寒之性会伤及脾阳、损及正气[13]。正如《景岳全书》指出：“脾胃不足及虚弱失调之人，多有积聚之病”，故温阳补脾、健运中州对肿瘤的治疗至关重要。灸法治疗肿瘤历史悠久，早在《黄帝内经》一书中就有用灸法治疗癥瘕、积聚(肿瘤)的记载[14],《景岳全书》提出:“大结大滞者，最不易散，必欲散之，非借火力不能速也，所以极宜用灸”。麦粒灸是艾炷直接灸最经典的方法，具有热力高、渗透强和疗效突出等优点，在防治疑难病过程中具有独特效应，为当代著名灸法大师谢锡亮先生毕生所倡导[15]。

课题组前期实验发现麦粒灸对荷瘤小鼠化疗后可明显提高白细胞数量、改善骨髓抑制状态和提高机体免疫力，起到减毒作用[16]。且李丽君等[17]发现通过艾灸温热效应能明显降低肉瘤微环境中FGFR1和VEGFR2的表达，抑制血管生成，从而抑制肿瘤生长。上述证实了麦粒灸温补、温通之能对肿瘤的“虚”“寒”起到重要治疗作用，故以“虚者补之、寒者温之”为原则取穴。大椎为诸阳之会，灸之可振奋阳气。现代研究表明麦粒灸大椎穴能提高机体免疫力，起到抑瘤作用[18-19]。足三里乃足阳明胃经下合穴，是强壮保健要穴，具有补益脾胃之功。黄文娟等[10]发现艾灸荷瘤小鼠“后三里穴”可促进Th1型细胞因子产生，纠正荷瘤导致的Th1/Th2失衡，有效抑制肿瘤的生长。三阴交乃肝、脾和肾三阴经交会穴，灸之可温阳健脾、培元固本，故本实验采用麦粒灸大椎、足三里与三阴交对荷瘤小鼠进行干预治疗。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡形式，可有序有效地去除受损细胞[20-21]。异常的细胞凋亡导致细胞内部环境紊乱,进而促进肿瘤的发生、发展，而诱导细胞凋亡是抑制肿瘤生长的主要方式之一[22-23]。在诱导肿瘤细胞凋亡过程中，诸多抑癌基因发挥着不同的作用，如控制细胞自主、有序死亡的P53、caspase家族和Bcl-2家族等，其功能异常与多种疾病相关，包括癌症、神经退行性疾病和自身免疫疾病等[24-25]。而Bcl-2蛋白家族是线粒体渗透能力转换的重要调节者，直接或间接影响线粒体的通透性以调节或破坏细胞内稳态和死亡，从而在细胞凋亡中发挥关键作用[26]。Bax蛋白作为促凋亡调节因子，通过与Bcl-2和其他Bcl-2蛋白家族成员的同二聚和异二聚作用诱导细胞死亡；Bcl-2蛋白作为抗凋亡调节因子，通过线粒体外膜通透性促进细胞死亡[27]。换言之，当Bax形成同源二聚体或Bax过度表达时，均可拮抗Bcl-2的保护作用而使细胞趋于凋亡[28-29]。因此，Bcl-2家族的促凋亡和抗凋亡成员之间的平衡可以决定细胞的增殖与凋亡。本实验研究结果显示，Hepa1-6荷瘤小鼠经CTX或麦粒灸治疗后，肿瘤组织中Bax表达呈上升趋势，Bcl-2表达呈下降趋势，尤以CTX组最为显著，提示麦粒灸或CTX均能促进肿瘤细胞凋亡。此外，实验结果还发现麦粒灸+CTX组Bax、Bcl-2表达水平最为显著，抑瘤率优于单独应用麦粒灸或CTX治疗组，表明麦粒灸与CTX合用治疗肿瘤可起到协同增效的作用。

综上所述，麦粒灸对肿瘤有明显的抑制作用，并在一定程度上能够改善荷瘤小鼠的生存状态；与CTX联用时，抑瘤作用更佳。二者联合使用在促进肿瘤细胞凋亡的同时又能改善小鼠的生存状态，起协同增效作用，其机制可能与调节Bax、Bcl-2的表达有关。由于Bcl-2家族蛋白功能及结构的复杂性和多样性，加之Hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤细胞的发生、发展、转移与临床患者自身肿瘤细胞之间存在差异，因此，麦粒灸对荷瘤小鼠肿瘤细胞的抑瘤作用机制尚需进一步深入研究。