重金属对煤矿区土壤线虫群落结构的影响

成碧君，刘良坡，张红梅，杨秀娟

（山西医科大学 公共卫生学院，山西 太原 030001）

近年来，重金属污染引起的生态环境问题日益增多，其中煤矿开采直接或间接地造成土壤重金属污染。山西煤炭资源丰富，但是煤炭资源开采造成生态的严重破坏，煤矸石、粉煤灰等固体废物历史堆存总量较大，对周围土壤造成重金属污染和蓄积，存在环境安全隐患，影响公众健康[1-2]。研究显示，我国农田土壤重金属含量最高的是Cr、As、Cu和Ni[3]，其中，Cr空间插值次高值区出现在山西[4]。何建国等[5]研究发现，皖北煤矿区土壤中As、Cr、Cu、Ni、Zn的平均含量超出安徽省土壤背景值的55%、16%、35%、18%、22%，且Zn和Cu易于迁移到小麦的籽粒中。赵颖等[6]研究发现，太原市小店区土壤重金属Cr、Cu、Zn含量分别为44.32～130.12、55.00～252.72、20.40～70.51 mg/kg，且根茎类和瓜菜类重金属污染处于轻度污染水平，对儿童具有潜在健康风险。重金属是持久性的污染物，在土壤中过量沉积引起土壤质量下降，导致土壤退化、抑制土壤生物体活性、存在潜在的生态风险[7]。崔雅红等[8]研究发现，陕西蒿坪石煤矿区土壤中Cu和Zn元素含量都已超过陕西土壤背景值，且受到Cu和Zn轻度污染，存在轻微的生态风险。鲁西南地区某煤矿区土壤中Cr、Ni、Zn含量均值明显高于山东省背景值，Ni元素存在小范围轻度污染区域[9]。山西沁源、古交、阳泉的一项研究发现，煤矸石堆放区附近村庄土壤中As、Ni等重金属对当地儿童早期神经发育构成潜在威胁；土壤渗滤液干扰了与斑马鱼（Danio rerio）早期神经发育相关的关键发育过程，导致斑马鱼幼虫活动减退[10]。Ni和As等重金属污染产生的毒性会降低土壤营养因子含量，破坏蜱螨类敏感土壤动物的食物链，使土壤动物数量减少、生物多样性降低[11]。重金属Ni对公路两侧蚂蚁、蜈蚣、隐翅虫（Staphvlinidae）等大型土壤动物群落结构有较大的影响[12]。ŠALAMÚN等[13]研究发现，Cr对于线虫群落结构有着显著的毒性，并且对线虫丰度、多样性和生态指数均产生了负面影响。侯磊等[14]初步估计，青藏高原高寒草甸内部不同区域的土壤线虫群落结构上的差异可能与重金属含量中Cu和Zn能刺激线虫卵孵化过程继而增加线虫丰度有关。因此，了解山西煤矿区土壤重金属污染情况及其对土壤生态系统的影响迫在眉睫。

线虫作为最丰富的土壤无脊椎动物，是土壤生态系统的重要组分，其对环境变化反应灵敏，土壤中重金属污染对于土壤的影响可通过线虫分布和活性变化来诊断[15]。重金属污染使土壤动物群落的物种多样性降低，土壤动物密度减小，群落结构趋于简单，土壤生态系统趋于退化[16]。随着土壤中重金属不断累积，扰乱了土壤生态平衡，同时土壤线虫的群落结构发生改变。多项研究表明，土壤线虫可作为对重金属污染敏感的生物指标[6-10]。XUE等[17]将秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）生长、繁殖和摄食行为的情况用于评估重金属Cd、Pb和Mn的毒性影响。SHARMA等[18]研究分析了重金属含量和土壤生态食物网之间的相关性，结果表明，土壤重金属Cr的污染与土壤食细菌线虫和食真菌线虫呈正相关关系。以往相关研究一般采取的是人为控制试验改变土壤中重金属含量来观察线虫群落结构的反应，多关注单一金属污染或者2种金属元素污染在短时间内所致的线虫群落结构变化[19-20]。然而煤矿区附近农田土壤中超标重金属种类多，受污染时间往往在几十年以上，对土壤生态系统造成了长期影响[21]。因此，研究多种重金属复合污染与线虫群落之间的关系是非常必要的。

目前对于土壤重金属污染的评估主要基于土壤中重金属含量[22-23]，而从土壤消费者这一角度研究重金属污染的影响，能够更加全面地反映重金属污染带来的生态风险。因此，本研究通过测定煤矿区附近农田土壤中重金属含量，利用土壤线虫各营养类群丰度、Shannon-Weaver多样性指数、线虫均匀度指数、成熟度指数、线虫通道指数、富集指数、结构指数等分析土壤线虫群落结构，采用冗余分析（redundancy analysis，RDA）和典型相关分析（canonical correlation analysis，CCA）探讨线虫群落结构生态指数与土壤重金属含量之间的关系，以期从土壤生物多样性方面研究重金属污染情况，有效评价线虫群落生态指数对重金属含量反应灵敏度，旨在为山西省土壤生态评价提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 研究区概况

试验于2018年在山西省晋中市（东经112°34′～113°8′，北纬37°23′～37°54′）北山煤矿区进行。该地属半干旱大陆性季风气候，海拔80 m，年平均气温9.8℃，降水量418～483 mm，年日照时数2 662 h，无霜期158 d。研究区域土壤类型为褐土，种植作物主要为玉米。

1.2 试验设计

本研究随机选取运煤公路和水源旁5个采样区的农田土壤进行调查采样，5个采样区分别标记为P1、P2、P3、P4和P5。P1位于煤矿区水源附近农田，P2、P3、P4、P5分别位于运煤公路旁的农田。为排除探矿、采矿等人类活动的影响，对照区选取远离矿区且无工业污染的一个采样区，标记为CK。通过测定采样区重金属As、Cr、Ni、Cu、Zn的含量，将对照区土壤重金属含量的平均值作为参考值，对土壤重金属的生态风险进行评价。

1.3 土壤线虫提取和分析

称取100 g新鲜土样，采用改良的浅盘法[24]分离收集土壤线虫。利用Olympus ZX10体视显微镜计数线虫总数，根据线虫形态特征和食性于Olympus BX51光学显微镜100×和400×下进行分类鉴定[25]。

根据线虫进食习性的不同及形态学上的差异，分为4种营养类群，分别为植物寄生线虫（plant parasites nematodes，PP）、食细菌线虫（bacterialfeeding nematodes，BF）、食真菌线虫（fungi-feeding nematodes，FF）和 捕 食 杂 食 线 虫（ominivores/carnivorous，O/C）[14，26-27]。

本研究应用各种指标对线虫群落结构进行描述。

1.3.1 线虫丰度和各营养类群相对丰度 线虫丰度和各营养类群相对丰度是指每100 g干燥土壤样品中的线虫总数和某营养类群的线虫数占线虫总数的比例[28]。

1.3.2 Shannon-Weaver指 数（H'）和Pielou指 数（J'）Shannon-Weaver指 数 和Pielou指 数 反 映 某区域土壤线虫营养类群和种类的多样性。

其中，Pi是某种属线虫在线虫总数中的比例，S是样本中的线虫种属数量[21，28]。Shannon-Weaver指数越大，表明线虫种属的数量越多，线虫多样性越丰富[21]。Pielou指数越大，表明各线虫种属之间数量差别越大，线虫群落结构越稳定[29]。

1.3.3 成熟度指数（maturity index，MI） 成熟度指数分为自由生活线虫（捕食杂食线虫、食细菌线虫和食真菌线虫）成熟度指数和植物寄生线虫成熟度指数（plant parasites nematodes maturity index，PPI），本研究使用的成熟度指数主要针对自由生活线虫[28]。

其中，fi是样本中某种线虫的个体数占线虫总数 的 比 例；vi是 该 线 虫 的c-p（colonizer-persister）值[28]。根据线虫群落的生活史策略，按照殖民者-居住者的定义将线虫赋予1～5的c-p值[27]。低MI值和高PPI值表明土壤生态系统成熟度越低，土壤生态系统扰动强烈，反之则表明土壤生态系统趋于稳定，受外界干扰影响程度越小[27-28]。

1.3.4 线虫通道指数（nematode channel ratio，NCR）线虫通道指数是食细菌线虫和食真菌线虫的比值，反映分解速率较快的基于细菌的能量通道和分解速率较慢的基于真菌的能量通道在分解过程中的相对重要性[28]。

其中，B和F分别是食细菌线虫和食真菌线虫的相对丰度。NCR值在1和0之间波动，NCR高 于0.5，说明土壤食物网以食细菌通道为主，土壤有机质以细菌分解途径为主，NCR低于0.5，说明土壤食物网以食真菌通道为主，土壤有机质以真菌分解途径为主[28]。

1.3.5 富集指数（enrichment index，EI）和结构指数（structure index，SI） 富集指数和结构指数二者相结合能够更好地指示土壤环境受扰动的情况和土壤食物网的状况[21]。

其中，b是食物网中的基础成分，通常指食细菌线虫和食真菌线虫中c-p值为2的两类群线虫；e是食物网中的富集成分，指食细菌线虫中c-p值为1和食真菌线虫中c-p值为2的两类群线虫；s为食物网中的结构成分，包括c-p值为3～5的食细菌线虫、食真菌线虫和捕食杂食线虫[21]。

其中，kb、ke、ks为各类群线虫所对应的加权值（其值为0.8～5.0），nb、ne、ns为各类群线虫的相对丰度，为各类群线虫所对应的加权值。结构指数越高，富集指数越低，表明土壤食物网越复杂，重金属对土壤环境扰动较小，反之则表明土壤养分呈现富集状态，受重金属扰动强烈[19]。

1.4 数据分析

采用R 4.1.0和SPSS Statistics 22.0软件对数据进行统计分析，利用Excel 2016、R 4.1.0和Origin 2018进行图表绘制。利用Kolmogorov-Smirnov检验判断数据是否符合正态分布；利用Levene法判断数据是否符合方差齐性检验。若数据方差齐且均显示正态分布，则利用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）进行差异分析，利用Student-Newman-Keuls法进行两两比较；若数据不符合正态分布或方差不齐，则采用非参数检验进行差异分析，利用Kruskal Wallis秩和检验法进行两两比较。通过Canoco 5软件进行冗余分析（RDA）和典型相关分析（CCA），找出土壤重金属含量与线虫群落结构指标及线虫种属丰度之间的相关关系。

2 结果与分析

2.1 土壤重金属含量基本特征分析

由表1可知，污染区重金属Cr、Cu、As、Zn的含量均与对照有显著差异。污染区5个采样区土壤Zn含量均显著高于对照。与《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）[30]中筛选值相比较，P4采样区的Zn含量是筛选值的1.82倍。对照区和污染区各采样点的样品As含量均超过了风险管制值，各个采样点中土壤Cr、Ni和Cu的含量均未超过筛选值和管制值。

表1 污染区和对照区土壤各重金属含量比较Tab.1 Comparison of heavy metal contents in soil of polluted area and control area mg/kg

2.2 土壤线虫群落结构分析

本研究共鉴定出20个线虫属，其中，食细菌线虫11属，食真菌线虫3属，植物寄生线虫4属，捕食杂食线虫2属。在对照区中占优势的线虫属主要有真滑刃属、原杆属、盘旋属；P1区优势线虫属主要是真滑刃属、茎属和孔咽属；P2区优势线虫属为真滑刃属和盘旋属；P3区优势线虫属有小杆属、中杆属、真滑刃属、盘旋属、丝尾垫刃属、孔咽属；P4区优势线虫属为真滑刃属；P5区优势线虫属是真滑刃属、茎属和滑刃属（表2）。

表2 土壤线虫的群落组成Tab.2 Community composition of nematodes in soil

污染区和对照区土壤中线虫总数存在显著差异，污染区线虫总数显著低于对照区（图1-A）。污染区P2和P5的线虫总数显著低于CK和P1（表3）。采样区CK和P3土壤中食细菌线虫占主要优势，P1、P4和P5土壤中占优势的主要是食真菌线虫，而P2中植物寄生线虫的相对丰度最高。污染区土壤线虫Shannon-Weaver多样性指数（H'）和线虫通道指数（NCR）均显著低于对照区（图1-D和图1-E）。污染区各采样区的线虫通道指数值均显著低于对照区，且低于0.6，说明污染区以食真菌线虫活动较为活跃。

图1 污染区和对照区土壤中线虫生态评价统计Fig.1 Statistics of ecological evaluation of nematodes in polluted area and control area

表3 土壤中线虫指标统计Tab.3 Statistics of the nematodes index in soil

2.3 土壤重金属含量对土壤线虫群落的影响

本研究通过冗余分析（RDA）和典型相关分析（CCA），探讨土壤重金属含量与线虫各种属相对丰度以及线虫群落结构指标之间的关系，为通过线虫群落结构来估计土壤重金属污染程度提供理论基础。

土壤线虫群落指标与重金属含量的RDA分析结果如图2所示，研究区域内的土壤线虫群落受重金属Cr和Ni的影响较大，其中，食真菌线虫相对丰度、捕食杂食线虫相对丰度、结构指数、成熟度指数均与重金属Zn、Cu、Ni、Cr、As含量呈负相关，植物寄生线虫相对丰度、食细菌线虫相对丰度、植物寄生线虫成熟度指数、线虫通道指数、Pielou指数均与这些重金属含量呈正相关。重金属Cu、Ni含量与植物寄生线虫成熟度指数表现出较强的正相关性，与结构指数表现出较强的负相关性；重金属Zn、As、Cr含量与植物寄生线虫相对丰度表现出较强的正相关性，与食真菌线虫相对丰度表现出较强的负相关性。重金属Zn、As、Cr、Cu、Ni含量与土壤线虫总丰度、富集指数、Shannon-Weaver指数的相关性都很低。

图2 土壤线虫群落指标与重金属含量RDA分析Fig.2 RDA analysis of soil nematode community indexes and heavy metal concent

为了探究土壤重金属污染影响的主要线虫种属，对污染区域的重金属含量和土壤线虫种属丰度进行典范对应分析，结果如图3所示。第1排序轴与土壤重金属Zn、As、Cr、Cu、Ni均表现出负相关关系，与土壤Cr负相关关系最强。这说明沿着第1排序轴从左到右，土壤重金属含量越来越高。第2排序轴与重金属Zn、As、Ni呈负相关关系，与重金属Cr、Cu呈正相关关系。说明沿着第2排序轴从下至上，土壤Zn含量越来越小，重金属Cr含量逐渐增加。第2排序轴与重金属Ni的相关性最强。通过排序轴分析，重金属Cr、Cu含量与线虫拟丽突属、螺旋属、丝尾垫刃属、滑刃属丰度呈正相关，与原杆属、孔咽属、真头叶属丰度呈负相关；重金属Zn、As、Ni含量与盆咽属、头叶属、真滑刃属、绕线属、似绕线属、棱咽属、拟矛线属丰度呈正相关，与丽突属、根结属、盘旋属、小杆属、根结属丰度呈负相关。

图3 土壤线虫种属相对丰度与重金属含量CCA分析Fig.3 CCA analysis of relative abundance of soil nematode genus and heavy metal concent

3 结论与讨论

本研究结果表明，污染区5个采样区重金属Cr、As、Cu、Zn的含量均显著高于对照区，而重金属Ni污染程度与对照相比无显著差异。罗妍等[31]研究发现，东北煤矿区表层土壤中Cr、Cu、Ni、Pb、Zn平均含量均超过了背景值0.89～1.85倍。土壤中重金属Ni含量受到煤矿开采影响的同时，还与土壤质地、地形、气候等自然因素控制有关[32]。对照区和污染区各采样区的样品As含量均超过了风险管制值，说明该矿区周边土壤中种植的食用农产品不符合质量安全标准，农用地土壤污染风险高，原则上应当采取禁止种植食用农产品、退耕还林等严格管控措施[33]。

污染区线虫总数显著低于对照区，食细菌线虫的相对丰度低于对照区，而食真菌线虫和捕食杂食线虫的相对丰度均高于对照区。重金属污染会造成线虫总数减少，这是由于重金属对线虫群落的直接毒性作用以及对线虫营养来源消耗的间接影响[29,34]。污染区线虫通道指数（NCR）显著较低，其原因是污染区土壤中食真菌线虫的数量较多，食细菌线虫的数量较少，食细菌线虫和食真菌线虫的数量变化被发现与重金属污染土壤中微生物数量有关[35]。污染区NCR值低于0.5，说明污染区土壤食物网以食真菌通道为主，土壤有机质以真菌分解途径为主。污染区和对照区线虫富集指数（EI）和结构指数（SI）差异不显著，表明重金属污染对土壤微生物和食物链长度的影响没有显著差异[36]。富集指数（EI）被用来评估食物网对可利用资源的响应，结构指数（SI）是用于揭示在人为干扰或生态恢复过程中土壤食物网结构变化的指标[28]。本研究污染区线虫富集指数（EI）低于对照区，结构指数（SI）则高于对照区，表明污染区土壤食物网由于重金属污染导致可利用资源和土壤养分减少。污染区Shannon-Weaver指数和Pielou指数均低于对照区，表明污染区线虫群落多样性降低。本研究中，污染区Shannon-Weaver指数和均匀度指数均低于对照区，表明线虫属数量的减少主要是由于线虫多样性的降低，其次是不同种属线虫相对丰富度的变化[29]。重金属污染对线虫群落的影响不仅体现在线虫单一种属的丰度变化，不同营养类群和c-p类群的线虫丰度上的变化也很明显[29]。成熟度指数（MI）是重金属污染引起的土壤反应的良好指示指标[21]。土壤Cu、Pb、Zn含量高均对线虫群落的成熟度有不利影响[21]。

土壤中重金属的不断累积，不仅使土壤质量发生了明显改变，同时扰乱了土壤生态平衡，土壤线虫的群落结构发生改变，从而影响农田作物的生长和产量[29，37]。本研究通过线虫各种属相对丰度与土壤重金属含量的RDA分析发现，Zn、Cu、Ni、Cr、As与食真菌线虫相对丰度均呈负相关，而与食细菌线虫相对丰度呈正相关，表明这5种重金属对食真菌线虫具有抑制作用，而对食细菌线虫存在一定的促进作用。SHARMA等[18]研究发现，As与食真菌线虫相对丰度有较弱的负相关关系，而Cr和Zn则与食细菌线虫相对丰度具有正相关关系，这与本研究结果一致。本研究中Zn与植物寄生线虫相对丰度有较强的相关性，这与Zn对植物寄生线虫拮抗菌（根瘤细菌、菌根真菌）和捕食杂食线虫的抑制等作用有关[38]。捕食杂食线虫与Zn、Cu、Ni、Cr和As呈负相关，这与ŠALAMÚN等[39]的研究结果一致。本研究中，Zn、Cu、Ni、Cr和As与土壤线虫结构指数和成熟度指数呈较为密切的负相关关系，与线虫通道指数和富集指数呈正相关。SÁNCHEZ-MORENO等[21]和GEORGIEVA等[38]研 究发现，重金 属Ni、Zn和Cu对线虫群落具有毒性作用，对土壤线虫结构指数和成熟度指数有显著的不利影响，但对线虫富集指数有积极影响。PARK等[29]研究表明，重金属Cu和Ni的含量超过100 mg/kg会对自由生活线虫成熟度指数产生负面影响。ŠALAMÚN等[13]研究发现，自由生活线虫成熟度指数和结构指数与重金属Cr含量存在明显的负相关关系。因此，可推测土壤线虫结构指数和成熟度指数对土壤重金属污染的响应敏感。本研究中土壤线虫总丰度与重金属含量相关性不强，对于指示Zn、Cu、Ni、Cr和As污染的灵敏度较低，被认为是最不敏感的线虫群落指标[20]。

土壤线虫种属与特定重金属元素之间的关系在一定程度上受到线虫群落结构较高变化频率和收集数据中个别种属缺乏的阻碍，这是研究重金属与线虫之间相关关系的一个重大障碍[40]。同一营养类群的不同种属线虫对重金属污染的反应不同；CCA分析发现，重金属Zn、As、Ni与食细菌线虫头叶属、绕线属、似绕线属、棱咽属丰度呈正相关，而与食细菌线虫丽突属、小杆属丰度呈负相关，推测特定种属对于重金属含量的反应不是单一种属线虫的体现，而是土壤生态系统和线虫群落的综合体现[40]。重金属污染对线虫丰富度和多样性均有负面影响，线虫群落功能冗余的残存可使得线虫结构指数回升，使污染区的生态实现自我调整[21]。通过RDA分析各重金属含量和线虫群落指标的结果发现，重金属Zn、Cu、Ni、Cr和As与土壤线虫结构指数和成熟度指数呈较强的负相关关系，可作为线虫群落指示土壤重金属污染的合适指标[39]。

本研究结果表明，山西省某煤矿区土壤As含量大于风险管制值，超过土壤环境质量的风险管控标准，应予以重点关注；重金属污染造成土壤线虫总数显著降低；Cr和Ni对土壤线虫群落结构影响最大，土壤线虫结构指数和成熟度指数可作为指示土壤重金属污染的指标。