中药补肾解毒方对辐射后孕鼠胎盘损伤的防护作用及氧化应激的影响

高 庆 李延晖 谭德慧 杨云霜

(1 中国人民解放军火箭军特色医学中心中医科，北京，100088； 2 北京市隆福医院中医科，北京，100010)

随着近年科学技术的飞速发展，核能开始被广泛应用于军事、医学以及人类的日常生活当中，其造福人类的作用显而易见，但同时可能对人类产生一定的辐射损伤，有关辐射危害已然成为当下全球亟待解决的重大问题[1-2]。正常情况下，人类日常生活中基本上不会接触大剂量的辐射，但是人类接触中、低剂量辐射的概率较大[3]。生殖是人类繁衍生息的重要方式，随着人类对辐射危害的认知日益深入，中、低剂量的辐射对人类生殖的影响开始受到广泛的关注[4]。鉴于此，本文通过研究中药补肾解毒方对辐射后孕鼠胎盘损伤的防护作用及对氧化应激的影响，为中药补肾解毒方应用于辐射后孕鼠防护提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选择清洁级健康C57 BL/6 J雌性小鼠50只，体质量为(22±1)g；雄性小鼠25只，体质量为(25±2)g，均为12周龄。所有大鼠均购自北京鑫源顺康科技有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0008。放置于医院动物饲养室饲养，无饮食、饮水的限制。本实验经动物福利伦理委员会批准通过(伦理审批号：20200429)。

1.1.2 药物 补肾解毒方(方药组成：熟地黄10 g、山茱萸12 g、山药10 g、牡丹皮10 g、茯苓10 g、泽泻10 g、冬虫夏草3 g、白花蛇舌草10 g)由北京康仁堂药业有限公司中药颗粒剂配制而成。

1.1.3 试剂与仪器 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)(北京瑞格博科技发展有限公司，批号：019246)，谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)(北京瑞格博科技发展有限公司，批号：02065)，丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒(北京瑞格博科技发展有限公司，批号：020635)，戊二醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：0198)，多聚甲醛固定液(国药集团化学试剂有限公司，批号：0254)，磷酸缓冲盐溶液(PBS)国药集团化学试剂有限公司，批号：0366)，电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司，型号：BSA224S)，辐射源为60Coγ-射线照射(北京伽玛高新有限公司，型号：GM-11-03-A)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1)分组：将所有受孕小鼠按照随机数字表法分为空白对照组，低剂量辐射组，中剂量辐射组，低剂量辐射+补肾解毒方组，中剂量辐射+补肾解毒方组，每组10只。2)模型制备:将所有实验小鼠进行为期3 d的适应性饲养之后，排除动情周期异常者，将雄鼠与处于动情前期的雌鼠按1∶2比例合笼交配，于次日清晨行雌鼠阴道涂片检查精子，以发现阴栓和查到精子为受孕标志。

1.2.2 干预方法 低剂量辐射+补肾解毒方组和中剂量辐射+补肾解毒方组大鼠予以补肾解毒方灌胃干预，给药剂量为13.5 g/(kg·d)。空白对照组，低剂量辐射组，中剂量辐射组则予以等体积的生理盐水灌胃。各组连续灌胃10 d后，除空白对照组外，其余4组大鼠均予以γ射线照射，其中低剂量辐射与低剂量辐射+补肾解毒方组γ射线照射剂量为2 Gy，中剂量辐射组与中剂量辐射+补肾解毒方组γ射线照射剂量为4 Gy。孕鼠分娩时取胎盘，称重后，一部分胎盘用生理盐水漂洗，立即投入液氮中固定，于-80 ℃冰箱中保存，另一部分胎盘中性甲醛固定；仔鼠出生60 d，摘眼球取血，血液立即送检；随后断颈处死，分别摘取卵巢、睾丸组织，称重后，中性甲醛固定。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 胎盘指数计算 取出孕鼠子宫，剖开子宫后去除胎鼠胞衣，并将胎鼠和胎盘迅速剥离，逐一对应后称重，胎盘指数=(胎盘质量/胎鼠质量)×100%。

1.2.3.2 氧化应激指标检测 取部分称量后的胎盘组织，采用磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗，制作成质量分数为10%的组织匀浆，并遵循试剂盒说明书完成SOD、GSH-Px以及MDS的检测。

2 结果

2.1 各组孕鼠妊娠结局比较 低剂量辐射组与中剂量辐射组孕鼠的活胎率明显低于空白对照组；且死胎率高于空白对照组，而低剂量辐射+补肾解毒方组、中剂量辐射+补肾解毒方组孕鼠的活胎率明显高于低剂量辐射组与中剂量辐射组，且死胎率低于死胎率低剂量辐射组与中剂量辐射组，各组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 各组孕鼠妊娠结局比较[只(%)]

2.2 各组仔鼠一般情况和胎盘指数比较 低剂量辐射组与中剂量辐射组仔鼠体质量、身长、尾长以及胎盘指数均明显低于空白对照组，而低剂量辐射+补肾解毒方组，中剂量辐射+补肾解毒方组仔鼠体质量、身长、尾长以及胎盘指数均明显高于低剂量辐射组与中剂量辐射组，各组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2，图1。

表2 各组仔鼠一般情况以及胎盘指数比较

图1 各组光镜下胎盘组织病理学情况(HE染色，×400)

2.3 各组孕鼠氧化应激指标水平比较 低剂量辐射组与中剂量辐射组孕鼠SOD、GSH-Px水平均低于空白对照组，而MDA水平高于空白对照组；低剂量辐射+补肾解毒方与中剂量辐射+补肾解毒方组孕鼠SOD、GSH-Px水平均高于空白对照组，而MDA水平低于空白对照组；各组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表3 各组孕鼠氧化应激指标水平比较

3 讨论

既往，国内外针对辐射防护以及辐射防护药物的研究主要集中在肿瘤治疗、美容、农业以及原子能工业中，虽然越来越多的辐射防护药物不断被开发应用，但有关中药复方进行辐射防护的研究并不多见[5-7]。随着近年来人类对中医药的研究日益深入，具备标本同治、防治结合以及低毒高效特点的中药受到了广泛的关注，更是成功进入了从事辐射防护研究者的视野，然而有关专门针对生殖技能以及子代健康防治的中药复方研究仍处于探索阶段[8-10]。中医认为，肾主生殖，乃藏精之所，于人体成长发育以及繁衍后代等多个方面起着至关重要的作用，和生殖系统关系密切，而电离辐射当属火热暴戾之邪，可直中脏腑，耗损肝肾之阴精，干扰生殖根本[11-14]。

本研究发现，辐射会在一定程度上降低孕鼠的活胎率，同时提高死胎率，且对仔鼠的体质量、身长、尾长以及胎盘指数均会产生明显不利的影响。而采用中药补肾解毒方干预之后，孕鼠的活胎率明显提高，且仔鼠的体质量、身长、尾长以及胎盘指数均得到不同程度的改善。这与乔祚等[15]的研究结果一致：加中药治疗孕鼠的活胎率明显高于仅用辐射治疗，且仔鼠的体质量、身长、尾长以及胎盘指数均明显高于仅用辐射治疗。提示了中药补肾解毒方可能具有辐射防护的作用，可明显减轻辐射对孕鼠胎盘造成的损伤，同时降低辐射对仔鼠正常生长发育的影响程度。考虑原因可能在于：补肾解毒方主要是在六味地黄丸的基础上化裁而来，且相应加入了冬虫夏草以及白花蛇舌草，其中六味地黄丸可发挥调节大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴的作用，继而可促进卵巢功能的恢复以及改善，对女性生殖具有积极促进作用[16]。余雷等[17]的研究报道也说明了这一点。而冬虫夏草味甘性温，秘精益气，专补命门；白花蛇舌草性寒苦，具有清热解毒、泻火热邪盛的功效，从而有利于减少辐射造成的热性损伤[18-20]。另外，本研究结果显示，低剂量辐射组与中剂量辐射组孕鼠SOD、GSH-Px水平均低于空白对照组，而MDA水平高于空白对照组；低剂量辐射+补肾解毒方与中剂量辐射+补肾解毒方组孕鼠SOD、GSH-Px水平均高于空白对照组，而MDA水平低于空白对照组。这提示中药补肾解毒方对辐射后孕鼠的氧化应激反应具有一定的缓解作用。究其原因可能在于冬虫夏草可有效调节抗氧化酶基因的表达，从而在一定程度上提升放射损伤小鼠的抗氧化能力；而白花蛇舌草具有一定的抗氧化作用。二者联合应用具有一定的协同作用，继而使氧化应激指标水平得到改善。由此可推测补肾解毒方对孕鼠的辐射防护作用机制可能和预防、修复胎盘组织氧化损伤有关。

综上所述，中药补肾解毒方对辐射后孕鼠胎盘损伤的防护作用显著，可明显减轻氧化应激损伤，改善孕鼠妊娠结局，值得临床重点关注。