LC-MS和LC-NMR在中药三萜和甾体类成分快速鉴定中的研究进展

李莲慧 吴正波 王 葳 李大山 王文静

云南中医药大学中药学院暨云南省南药可持续利用重点实验室，云南 昆明 650500

中药组成成分具有多样性，在使用时一般需结合辨证施治原则[1]，其品质与含量不但决定疾病防治效果，且直接影响患者的生命安全，所以有必要对中药中的指标性成分进行定性定量分析。三萜和甾体类化合物是许多珍贵中草药的主要有效成分，以游离或苷类形式广泛分布于自然界的天然药物中[2]。这两类化合物都有着广泛的药理活性，其中，抗肿瘤活性一直是国内外研究的热点[3-7]。有些已被用作药物或新先导化合物的可能来源[8]。但天然产物的内在多样性对分析、分离及检测带来了很大的挑战，在早期的一些研究中，这两类化合物通常被检测为复合物[9]，若要完成分子结构及其立体结构的鉴定多通过NMR、MS、XRD、UV、IR、ORD、CD等波谱数据综合分析，这不仅效率低、周期长、耗资大，不适合当前快速发展的新药研发过程，而且还经常导致活性成分尤其是低含量成分的丢失或破坏。迄今为止，单独针对此类成分结构鉴定的报道日益增加。因此，选用一项高选择性和高灵敏度检测技术是准确测定中药中这两类成分的重要选择，也是一种重要的发展趋势。

从单个技术采集到技术联用，中药化学成分分析采集技术层出不穷[10]。在联用技术中，液相色谱-质谱(LC-MS)和液相色谱-核磁共振(LC-NMR)联用技术以其相对较高的分辨率、灵敏度和专属性优势，广泛应用于医药、化工、生物、环保等领域[11-15]，近年来，该技术日臻完善，应用前景日渐广阔。相比于传统HPLC或NMR技术，将该技术运用于结构类型多样的三萜和甾体类成分，更能快速准确地提供结构鉴定的特征信息。

笔者在总结前人研究成果的基础上，结合最新研究动态，对近十年运用LC-MS和LC-NMR联用技术分析中药中三萜类和甾体类成分的方法进行了综述。

1 LC-MS联用技术研究现状

LC-MS联用是以高效液相色谱为分离方法，质谱为检测手段的现代分析技术。在对未知成分进行研究时，其原理是先基于高效液相色谱对于复杂样品的高分离能力得到相对单一的化合物，再串联质谱得到特征碎片离子等结构信息，结合已知结构化合物的裂解规律，对未知成分进行定性分析，此过程及目的也正好满足中药指纹图谱研究的需要[16-17]。

三萜类和甾体类化合物多以缺少生色团的苷类形式存在，传统的HPLC检测方法通常因灵敏度不高而很难对微量成分进行响应测定[18]。而质谱检测可克服基质抑制效应，提供化合物的分子量和结构信息，特别适合分析中药复杂基质中的三萜和甾体成分[9]。

质谱有高分辨质谱(HRMS)和低分辨质谱(LRMS)之分。基于HRMS灵敏度高、扫描速度快且质量范围宽，能提供母离子和子离子小数点后4～6位的精确质量测定等优点，该技术常被应用于中药化学成分的快速鉴定和区分分子量(MW)近似的化合物[19]。但HRMS缺少靶标性扫描模式，对微量成分的检测不如LRMS[20-21]。发展至今，HRMS主要有飞行时间质谱(time-of-flight，TOF)、四级杆串联飞行时间质谱(quadrupole time-of-flight，QTOF)和线性离子阱串联静电场轨道阱质谱(linear ion trap quadrupole-Orbitrap，LTQ-Orbitrap)等。常见的LRMS包括三重四级杆质谱(triple quadrupole，TQ)、离子阱质谱(ion trap，IT)，以及结合了前两种质谱优点的三重四级杆线性离子阱质谱(triple quadrupole linear ion trap，QTRAP)[22]，另外，离子迁移谱与质谱联用作为一种新型分析技术，对于较低含量组分的分析鉴定有着重要意义，也常用于药物的质量控制、快速筛查和分析检测[23]。相对而言，LRMS的扫描速度与分辨率虽不及HRMS，但该技术具有多种特有的扫描模式，对微量与痕量成分的检测具有一定优势[24-25]。因此，将优势互补组合的HRMS-LRMS用于中药成分鉴定更能提高检测效率。现将已报道的，针对中药三萜和甾体类成分快速鉴定，对完善中药质量评价能够提供技术支持的现代联用技术的几类常用方法介绍如下。

1.1 液相色谱-离子阱质谱(IT-MS)联用 Sut等[26]为了阐明银背委陵菜(Potentilla argentea)和直立委陵菜(Potentilla recta)水提物的生物制药潜力，采用一维、二维核磁共振结合LC-DAD-ESI-MS和LC-APCI-MS技术，建立了LC-MS、NMR化学相关图谱，鉴定出鞣花素、黄酮醇苷和三萜等成分，并对每个成分进行定量分析，最终证明两种植物的水提物都是最有效的ABTS清除剂。

孟月华等[27]应用Finnigan LCQ Fleet IT-MS对预知子提取物在ESI-MSn负离子模式下能够得到较多三萜皂苷类成分的多级裂解信息，结果发现裂解形成的皂苷元以常春藤皂苷元(m/z 471)及少量阿江榄仁酸(m/z 487)、齐墩果酸(m/z 455)等为主，这些特征苷元碎片离子可作为鉴定皂苷类型的直接依据，最后共推测鉴定了17种皂苷类成分，为建立该类化合物的LC-MS指纹图谱提供参考方法。

相比于其它联用技术，IT-MS存在稳定性差、动态范围窄、质量歧视效应难以规避及软件适配度差等问题，但IT-MS成本较低，适用于三萜、甾体类分子结构的局部分析。

1.2 液相色谱-飞行时间串联质谱(QTOF-MS)联用 Xia等[28]利用超高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-QTOF-MS)在SWATH MSE模式下，同时采集前体离子[M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+和相应的碎片离子，对刺五加叶片中的三萜皂苷进行综合结构表征。SWATH MS作为一种互补的信息采集技术用于分辨洗脱物的结构。结果共有89个三萜皂苷和14个皂苷元被明确鉴定。在这些化合物中，有33个被鉴定为潜在的新化合物，包括首次报道的刺五加属中的malonyl-saponin。此外，在进行多元统计分析后发现，大多数的三萜类化合物是大量稳定存在的，Xia等[28]建议将其中几个三萜皂苷作为建立刺五加化学成分指纹图谱以及质量评价的新指标成分。

Król-Kogus等[29]采用HPLC-ELSD-ESI-QTOF-MS方法对波兰栽培的葫芦巴种子中的甾体皂苷复合物进行了定性和定量分析，该研究首次将两根C-18柱串联分析胡芦巴皂苷，并对ELSD检测器参数进行了优化。在此方法下共检测出26种呋甾固醇皂苷，其中24种已完成初步鉴定。在对波兰和亚洲葫芦巴种子中的总皂苷HPLC-MS图谱进行比较后发现，不同品种的皂苷种类和含量都存在显著差异，与亚洲品种相比，波兰胡芦巴种子中原薯蓣皂苷含量最高，而其他甾体皂苷含量相对较少。

由此可见，LC-QTOF-MS由于离子化效率提高，在化合物结构鉴别方面存在较大优势，可作为分析三萜和甾体及其皂苷的一种常用方法，但在色谱分辨能力上往往不足以分离分子量近似的化合物。应用LC-MS/MS，可以提供苷元独特的裂解模式，包括附着在苷元上的糖基的数量和类型的信息，以进一步完善化合物的结构表征[30]。

Ling等[8]开发了一种分离和表征芦笋(Asparagus cochinchinensis，RAC)干根药材中主要活性成分——甾体皂苷的一种方法。该研究首次使用电喷雾电离与四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-ESI-QTOF-MS/MS)相结合的新型高效液相色谱法对RAC中甾体皂苷进行系统鉴定。此方法因运用串联质谱，裂解所得到的离子信息得以进一步放大，所以即使在极低浓度下，甾体皂苷也具有丰富的苷元和糖链结构解析信息。最后，共检测和鉴定了30个甾体皂苷，其中包括17个潜在的新化合物。此方法可广泛应用于化学成分相对复杂样品的综合分析，可为进一步建立指纹图谱进行质量控制提供化学基础。但此方法在对糖单元的连接位置确认上仍有一定局限性。

Li等[31]在UHPLC-QTOF-MS/MS分析基础上，建立多反应检测扫描(MRM)的特征离子采集方法，对泽泻三萜类成分进行了全面表征，通过建立指纹图谱对不同产地、不同炮制手段的泽泻样品中三萜类成分进行成分差异研究。基于QTRAP-MS/MS的MRM技术建立的特征轮廓谱能够将复杂的QTOF总离子流色谱图简化，采用此方法测定泽泻三萜化合物，其响应值约为QTOF-MS/MS的3倍，因此特别适合微量化合物的定性和定量分析。谱图显示，不同产地的泽泻样品经炮制后其三萜类成分的相对含量发生不同程度变化。该研究所建立的MRM特征轮廓谱分析方法对不同产地/炮制手段的泽泻药材质量控制具有潜在的应用价值。

Q-TOF的出现有效地解决了中药分析中组分复杂、定量困难等问题，但Q-TOF只能形成二级碎片，对于未知结构化合物的解析尚有不足，且离子源更换麻烦，配套的液相系统稳定性欠佳，在后期发展中应更注重硬件适配问题。

1.3 液相色谱-三重四极杆质谱(TQ-MS)联用 鉴于triple TOF-MS/MS具有较强的全扫描定性分析能力，而QTRAP-MS/MS具有良好的定量灵敏度和稳定性，Chen等[32]将两种技术的优势充分结合，采用超快速液相色谱-三重四极杆串联质谱(UFLC-Triple TOF-MS/MS)和超快速液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱(UFLC-QTRAP-MS/MS)对西洋参(PJR)中的皂苷建立定性定量分析方法；采用UFLC-Triple TOF-MS/MS对PJR中的皂苷成分进行鉴定，通过标准品对照分析，明确鉴定出23种皂苷，其余皂苷通过裂解行为分析也得以初步推断。采用UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定不同采收时间的PJR样品中13种皂苷的含量，并通过灰色关联度分析(Grey Relational Analysis, GRA)对样本质量进行了评价，为确定PJR最佳采收期提供了基本信息，对其质量评价和控制有一定的指导意义。

在MRM应用于三萜苷类的分析表征时，广泛使用传统的直接进样方式，此方法下，MRM离子对的使用并不规范。为此，Xia等[33]研究发现，三萜皂苷经温和的气相分解质子化或形成氨化前体(DPAP)后，可以高效、稳定地生成一系列丰富的配基离子([A+H-nH2O]+(n = 0，1，2，3，…)。基于这些考虑和发现，他们在QTRAP 4000仪器上设计了一种创新性的ESI+-MRM-DPAP-MS方案，可以对植物中的三萜皂苷进行快速定性和定量分析。通过对20种中草药中85个模型化合物的详细研究，经验证、评价后正式提出了ESI+-MRM-DPAP-MS策略。他们将该方法实际应用于三七(Panax notoginseng)、红毛七(Caulophyllum robustum)、龙牙楤木(Aralia elata)等中药中的总三萜多元物质群叠加图谱采集，作为构建质量控制的综合评价平台，也表现出良好的敏感性、稳定性和重复性。

TQ-MS在保留了原四极杆质谱的强定量能力的基础上，提供了串级功能，使质谱的定性能力和效率进一步加强。除一般离子扫描功能外，TQ-MS还具有SRM、MRM、母离子扫描等功能，且MSM信噪比也有了明显提高，这对特征基团的结构研究有很大帮助。但TQ-MS在分辨率方面仍有不足，在进行三萜、甾体类化合物鉴别时，近似m/z离子的干扰比较大。

1.4 液相色谱-离子淌度(迁移)质谱(IMS)联用 上述质谱方法为三萜和甾体的结构表征提供了极大的便利，但在鉴定结构上仅具有细微差异的同分异构化合物时仍具挑战性，所以难以建立准确、完整的HPLC/UPLC图谱。而Colson等[34]发现，利用目标组分在行波离子迁移质谱(TWIMS)中离子迁移到达时间分布(ATD)的不同，可对立体异构和位置异构混合物进行部分分离。但因同分异构体皂苷ATD差异微小，必须先用液相色谱进行初步分离，后用TWIMS分析才能监测到。基于此，他们通过整合上述方法再结合MALDI-TOF、LC-MS和碰撞诱导解离实验分析了七叶树(horse chestnut，HC)种子中的皂苷提取物，使结构极其相似的七叶皂苷和异七叶皂苷得以分离鉴定。此方法的开发又大大拓展了质谱的性能和应用范围，为进一步完善三萜、甾体类指纹图谱，提升中药质量标准提供了新的思路。

Feng等[35]针对茯苓提取物中羊毛甾烷类化合物提出了一种基于UPLC-IMS-MSE联用技术，并结合UNIFITM软件对所获取的MS数据进行有针对性的过滤，建立内部化合物数据库，以快速区分和鉴别该提取物中同分异构体的分析策略。因IMS可以根据质谱的电荷状态、形状、尺寸进行第二次分离，使得UPLC-IMS-MSE组合分析技术在分离鉴定方面更具优势。在此方法下，根据化合物的中性丢失、特征离子、裂解途径情况，最终共鉴定出121种羊毛脂甾烷型三萜酸，其中有三种化合物被首次检测到。

面对中药成分结构类型多样、浓度变化大、极性跨度大、异构体广泛等挑战，色谱和质谱联用技术不断发展，在维度方面也继续提升。以UPLC/IM-QTOF-HDMSE为代表，由离子迁移率提供离子分离附加维数，UPLC进一步对成分进行洗脱保留分离，使QTOF-MS得到了更多的结构鉴别信息。这对从中药的众多成分中有选择性地直接分析目标结构类型具有重要意义。

Huang等[36]在对桔梗的化学成分进行综合表征时运用UPLC/IM-QTOF-HDMSE联用技术，根据同位素丰度、元素组成和碎片离子信息，初步鉴定了187个化合物，其中三萜皂苷为85个。对洗脱顺序进行重点考察后确定C-3位上糖基与苷元的连接方式是三萜皂苷结构异构化的主要原因。在分析桔梗皂苷异构体时，对UPLC/IM-QTOF-HDMSE和UPLC-QTOF-MSE两种联用技术进行比较，发现前者鉴别的数量是后者的两倍以上，由此可见此联用平台可支持结构复杂多样成分的深入研究。

近年来，IMS在异构体分析方面彰显出极大的优势，但该技术缺乏离子迁移主要标准，分析速度受迁移率与质谱仪间界面效率的限制，因此，要将IMS用于三萜、甾体类化合物的快速鉴定需在上述问题上有所改善。

2 LC-NMR联用技术研究现状

传统的三萜和甾体类化合物的结构表征分析方法，主要使用单一的核磁共振(NMR)技术对已纯化的样品进行结构表征，这使得样品的前处理耗时费力。因此，对快速识别和表征结构方法的需求越来越大。

现今，LC-NMR的相关运用在天然产物鉴定[37]、多聚物分析[38]、异构体研究[39]等领域的应用迅速增多。HPLC-NMR能够将分离和结构鉴定连为一体，大大简化了分析过程。随着该技术在药物化学中的普遍应用，现已逐渐成为这一领域中最强有力的分析手段之一，继而也推动了药材、饮片、提取物以及制剂的物质基础研究[40]，为建立更加有效、科学、可行的质量评价体系，提升完善中药质量标准提供了重要支撑。

LC-NMR联用技术最常见的有LC-NMR直接在线联用和液相色谱-固相萃取-核磁共振(LC-SPE-NMR)在线联用两种模式，随着分析要求的提高，LC-NMR又与质谱(MS)、尺寸排阻(SEC)等技术联合，LC-MS-NMR和LC-SEC-NMR联用等技术应运而生。

Horník等[41]以荨麻根提取物为研究对象，比较了已有的HPLC-NMR法与他们自己开发的SEC-NMR法用于快速筛选植物甾醇的优缺点。在进行HPLC-NMR检测后，共分离检测到9种主要成分，在相似的游离植物甾醇1H NMR波谱中，明确鉴别Δ5-Avenasterol、Campesterol和β-Sitostanol等7种甾醇。此方法虽灵敏度较高，却比较耗时；SEC-NMR法检测速度相对较快，但由于检测的是一段时间的洗脱成分，所以无法避免强烈的信号重叠，经条件优化后分离度有所提高，但灵敏度低、定量限过高等问题依然存在。由此可见，HPLC-NMR法用于分析甾醇类物质更具优势。

LC-SPE-NMR是一个相对较新的概念，Koning等[42]于1998年第一次发表了在线SPE装插与NMR探针耦合的例子，后续才有人报道相关的应用。

Khakimov等[43]以冬芥(barbarea vulgaris, winter cress)的无毛型(G)和短柔毛型(P)为研究对象，展示了一种利用GC-MS、LC-MS/MS和LC-SPE-NMR/MS联用分析平台筛选三萜皂苷的方法。该研究使用Bruker/Spark Prospekt 2 LC-SPE系统连接MicroTOF质谱，以15min为一个收集点，通过LC-SPE-NMR/MS和GC-MS分析洗脱液后发现，两种冬芥中的8种三萜苷元的分子量存在差异。若单独使用各种分析方法，要实现从复杂的混合物样品中直接阐明皂苷的完整结构是具有较高挑战性，然而，多个平台联合使用，可以获得大量关于苷元的结构以及糖基的数量和连接位置等综合信息。Khakimov等[43]所提出的方法实现了详细比较植物提取物中的完整皂素谱以及水解样品中的皂素苷元谱。

LC-NMR有多种操作模式，如连续流、环贮流、停流等，不同模式在图谱质量、分析时间上有明显区别，在实际操作中，可根据样品的特性和检测目的来灵活调节。目前，该技术相对较低的灵敏度和较高的鉴定限是阻碍其发展的根本原因之一。在分析三萜和甾体类化合物时，为了提高该技术的灵敏度，大多研究者会选择在NMR探头、磁体、参数、运行模式上做调节，但对HPLC系统操作条件的选择和优化也是重要的措施之一。

Goulas等[44]以HPLC-SPE-NMR和HPLC-DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)联用为分析手段，对狭叶香科Teucrium polium的提取物进行研究。在多次实验后，在0.1%醋酸溶液(A)和乙腈(B)梯度洗脱，0.6 mL/min流速，Bruker AV-500NMR仪，3 mm LC SEI 13 C- 1H探头测定条件下，发现了在狭叶香科中含量最高、活性最强的成分为金石蚕苷，抗氧化的主要成分为毛蕊花苷和二甲氧基槲皮素。此条件下，可于在线检测的同时，直接建立LC-NMR信号图谱，实现以最快速度对其中的三萜苷类进行归属和指认，且对于特征的末端官能团而言，峰的信号强度还可作为定量的依据。

3 总结与展望

文章综述了近十年来LC-MS和LC-NMR联用技术用于三萜和甾体类化合物的分离、检测和鉴别，可推动中药材的质量控制标准的分析手段和方法进一步完善。三萜和甾体类化合物虽结构类型多样，但却有规律可循，尤其在LC-MS中三萜皂苷类中各类糖基断裂产生的中性丢失是最为明显的裂解特征，而后期UPLC的引入，无论在灵敏度还是在准确性上都有所提高。总体而言，两种联用技术的特点是将HPLC的高效分离能力和MS、NMR精确的结构表征能力巧妙结合起来，在应用过程中二者各有优劣，可合理综合使用。建立稳定、高效和准确的分析方法，无论是对中药整体还是其中的三萜、甾体类成分都有重大意义。在今后的研究过程中还应不断地优化LC-MS和LC-NMR联用技术向更快、更精准方向发展，推动中药化学成分指纹图谱的完善和建立。