HPLC梯度洗脱-多波长切换法同时测定固肾丸中4种成分含量*

李鹂，贺蓓蓓，黄良永，杜士明，3

[1.十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)药学部，十堰 442000；2.湖北医药学院药学院，十堰 442000；3.武当特色中药研究湖北省重点实验室(湖北医药学院)，十堰 442000]

固肾丸是我院自制的中药制剂(批准文号：鄂药制字Z20210292)。该制剂在我院临床使用了近30年，已被证明具有很好的疗效。其主要成分为淫羊藿、白芍、制何首乌、女贞子、熟地、菟丝子、当归等17味中药。具有养血健脾、温肾固本、补阴助阳、调节内分泌平衡的作用。用于肝肾亏虚所致的四肢无力，腰膝酸软；女子垂体功能障碍、宫冷不孕、男子肾虚不育等症。该制剂标准收载于《湖北省医疗机构制剂规范》(2011版)，标准中仅有淫羊藿苷的含量测定项[1]。而组方中女贞子、白芍、制何首乌、淫羊藿均为固肾丸的君药。为了提升该制剂的质量标准，全面反映君药的有效成分，保证制剂的有效性，本研究建立一种新的高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱-多波长切换法，同时对淫羊藿中主要成分淫羊藿苷、白芍的主要成分芍药苷、制何首乌的主要成分二苯乙烯苷、女贞子的主要成分红景天苷的含量进行测定，并对含量测定方法进行验证，确定4种测定成分的含量限度，为修订和提高该制剂的质量标准提供科学依据，也为下一步该制剂的HPLC指纹图谱研究提供方法学参考。

1 仪器与材料

1.1仪器 ThermoFisher Ultimate 3000 HPLC(美国赛默飞公司，LPG-3400泵、WPS-3000SL analyt进样器、TCC-3000柱温箱、VWD-3400四波长检测器)；变色龙色谱工作站v6.8中文版；色谱柱：OMNIBond HPLC column Orca ( C18，4.6 mm×250 mm，5μm )；科盟牌超声清洗机(KM-36C，40 kHz，0～250 W可调，广州科洁盟科技公司)；SHIMADZU AUW120D电子分析天平(感量：0.01 mg，日本岛津公司)；GWA-UN Pure Water system(北京普析通用仪器公司)等。

1.2药品与试剂 红景天苷对照品(批号：200605，含量：98%)、芍药苷对照品(批号：110736-202044，含量：96.8%)、二苯乙烯苷对照品(批号：110844-201109，含量：94.7%)、淫羊藿苷对照品(批号：110737-200415，110737-200413，含量：100%)均购自中国食品药品检定研究院。中药饮片：熟地(批号：20210401)、盐菟丝子(批号：20210301)白芍(批号：20210401)、川芎(批号：20210401)、醋延胡索(批号：20210301)、砂仁(批号：20200701)、党参(批号：20210401)、当归(批号：20210301)、醋香附(批号：20210101)、枸杞子(批号：20210301)、覆盆子(批号：20201001)、女贞子(批号：20210301)、乌附片(批号：20200601)、佛手(批号：20200801)、制何首乌(批号：20210401)、淫羊藿(批号：20200801)由湖北清大中药饮片有限公司生产；黄芪(批号：20210401)由湖北药昇中药科技有限公司生产。固肾丸3批次(批号：20210806，批号：20210506，批号：20210320，规格：10.5 g×45丸/盒)均由我院制剂室生产。乙腈(德国默克公司)为色谱纯；磷酸、乙醇、甲醇等试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1固肾丸的制备 处方：淫羊藿420 g、白芍225 g、何首乌280 g、女贞子280 g、熟地420 g、当归225 g、川芎140 g、醋延胡索225 g、砂仁84 g、党参252 g、黄芪420 g、覆盆子225 g、盐菟丝子280 g、枸杞子225 g、乌附片140 g、佛手225 g、香附225 g。

制备：按处方取中药材，洗净后烘干，粉碎成细粉，过筛(80目)，钴60辐照灭菌，与蜂蜜混匀(1：1)，制成大蜜丸，即得。

2.2色谱条件 以OMNIBond HPLC Orca C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)为色谱柱；以0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)为流动相，按表1进行梯度洗脱；按表2中规定时间-波长程序检测，波长分别为：220，230，320，270 nm；柱温：30 ℃；流速1.0 mL·min-1，理论塔板数以芍药苷的峰计算应不低于8000。

表1 梯度洗脱程序 Tab.1 Program of gradient elution

表2 时间-检测波长程序 Tab.2 Program of time-wavelength

2.3溶液的制备

2.3.1供试品溶液的制备 分别取3批次(批号：20210806，20210506，20210320)固肾丸，各10丸，剪碎成细粒状，混匀，取3.0 g，精密称定，分别置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇35 mL，称定质量，热水浴中将样品充分溶散后，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)60 min，放冷至室温，擦干锥形瓶外水分后再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。

2.3.2对照品溶液的制备 芍药苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷对照品溶液配制：分别精密称取芍药苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷对照品11.9，10.87，10.73 mg，各置10 mL量瓶中，避光操作，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成单一对照品贮备液 (1.1519，1.0294，1.073 mg·mL-1)，冷藏，备用。

红景天苷对照品溶液配制：取红景天苷对照品13.64 mg，精密称定，置25 mL量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.5347 mg·mL-1的对照品储备液，冷藏，备用。

2.3.3阴性样品溶液 按处方比例分别称取缺女贞子、白芍、制何首乌、淫羊藿的饮片粉末共约1.5 g，蜂蜜1.5 g，分别置于100 mL具塞锥形瓶中，按“2.3.1”项下方法操作，即得4种阴性样品溶液。

2.4系统适应性实验 分别精密吸取红景天苷对照品溶液 0.5 mL、芍药苷对照品溶液0.5 mL、二苯乙烯苷对照品溶液0.35 mL、淫羊藿苷对照品溶液0.4 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即成质量浓度分别为26.735，57.595，36.029，42.92 μg·mL-1的混合对照品溶液。精密吸取供试品溶液(批号：20210806)、混合对照品溶液及4种阴性样品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图，结果见图1。可知，红景天苷、芍药苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷的保留时间分别是17.20，28.00，35.16，51.27 min；理论塔板数均不低于8000；各待测成分的色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.5；阴性样对照品色谱图中均无干扰成分。

1:红景天苷；2.芍药苷；3.二苯乙烯苷；4.淫羊藿苷；A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.缺女贞子阴性样品；D.缺白芍阴性样品；E.缺何首乌阴性样品；F.缺淫羊藿阴性样品。图1 固肾丸中4种成分的色谱图 1.Salidroside；2.paeoniflorin；3.2,3,5,4'-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside；4.Icariin；A.mixed refernce;；B.test solution；C.negative sample without privet；D.negative sample without white peony；E.negative sample without polygonum multiflorum；F.negative sample without herba epimedii.Fig.1 Typical chromatograms of 4 components in Gushen wan

2.5线性关系的考察 分别精密吸取“2.3.2”项下对照品储备溶液适量，置同一量瓶中，加甲醇稀释成5组混合对照品溶液，浓度分别为红景天苷(267.350，133.675，26.735，5.347，2.674 μg·mL-1)，芍药苷(575.95，287.975，57.595，11.519，5.7595 μg·mL-1)，二苯乙烯苷(360.29，180.145，36.029，7.205 8，3.602 9 μg·mL-1)，淫羊藿苷(429.2，214.6，42.92，8.584，4.292 μg·mL-1)。分别按“2.2”项下的色谱条件进样测定，并记录各待测成分峰面积。分别以4个待测成分的质量浓度为横坐标(X，μg·mL-1)、相应峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程和线性范围，结果见表3。

表3 固肾丸中4种成分的线性关系考察结果 Tab.3 Linear relationships of four constituents in Gushen wan

2.6重复性实验 取同一批固肾丸(批号：20210806)10丸，剪碎，混匀，平行称取6份，每份3.0 g，精密称定，按照“2.3.1”项下方法制成6份供试品溶液，然后按照“2.2”项下的色谱条件，精密吸取各供试品溶液连续进样2次，记录各待测成分峰面积平均值。结果，红景天苷、芍药苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷峰面积的RSD(n=6)分别为1.91%，1.21%，0.91%，0.79%，表明该方法重复性较好。

2.7精密度实验 精密吸取“2.5”项下第三组混合对照品溶液(中间浓度)，连续进样6次，记录各待测成分峰面积。结果红景天苷、芍药苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷峰面积RSD(n=6)分别为1.37%，1.77%，1.27%，1.39%，表明仪器精密度良好。

2.8稳定性实验 取“2.3.1”项下供试品溶液(批号：20210806)适量，于室温下避光放置，在分别经过1，2，4，8，12，24 h后，精密吸取该供试品溶液按“2.2”项下的色谱条件进样测定，记录各待测成分峰面积。结果，红景天苷、芍药苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷的峰面积RSD(n=6)分别为0.99%，0.76%，0.43%，0.67%，表明供试品溶液在室温下避光放置24 h内稳定性良好。

2.9加样回收率实验 将已知含量的同一批固肾丸(批号：20210806)10丸，剪碎，混匀，称取6份，每份约1.5 g，精密称定，分别置于100 mL具塞锥形瓶瓶中。向6个锥形瓶中各精密加入“2.3.3”项下红景天苷、芍药苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷对照品储备液液0.80，0.95，0.60，0.75 mL，用50%乙醇补充至35.0 mL，按照“2.3.1”项下方法制成供试品溶液，然后按照“2.2”项下的色谱条件进样测定，记录各待测成分峰面积，将峰面积代入线性方程计算各成分的含量及加样回收率。结果红景天苷、芍药苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷的平均加样回收率分别为 101.41%，98.47%，101.32%，101.55%，RSD(n=6)均小于2%，表明该方法准确度好，见表4。

表4 固肾丸中4种成分的加样回收实验结果 Tab.4 Recovery rates of 4 components in Gushen wann=6

2.10样品测定 取“2.3.1” 项下制备好的3批供试品溶液，按照“2.2”项下的色谱条件进样测定，记录各待测成分峰面积，将峰面积代入线性方程计算样品中各成分的含量。以干燥品计算，3批固肾丸(批号分别为20210806，20210506，20210320)的水分含量分别是7.3%，5.0%，6.1%)；结果3批供试品溶液中红景天苷、芍药苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷的平均含量见表5。

表5 3批固肾丸中4种成分的含量测定结果 Tab.5 Results of content determination in Gushen wanmg·g-1，n=3

3 讨论

3.1色谱条件的选择 本研究采用HPLC梯度洗脱、多波长切换法同时测定固肾丸中4种成分的含量。前期流动相考察了乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.05%磷酸溶液等不同流动相体系，经过反复实验发现以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相按表2进行梯度洗脱时，色谱图的基线平稳，各色谱峰能较为完全分离，各测定成分峰型较好。检测波长选择，依据《中华人民共和国药典》一部中[2]女贞子、白芍、制何首乌、淫羊藿药材含量测定项下，红景天苷、芍药苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷的最佳检测波长分别为220，230，320，270 nm，因此本研究选择采用多波长切换法，结合色谱图中的各测定成分保留时间采用时间-波长程序控制最佳检测波长，提高各测定成分的检测灵敏度。

3.2提取方法的选择 本研究前期考察了超声提取[3-8]、加热回流提取[3-4，9]、SPE提取[10-14]，提取时间均为60 min，结果发现，采用上述方法提取时，样品中的测定成分含量无明显差异，对固肾丸中测定成分提取效率基本相同，考虑到操作的简便性，故采用超声提取法(40 kHz，250 W)；采用单因素优化法，对超声提取的超声时间(30，60，90 min)进行考察，发现超声60，90 min时提取效率差异较小，但均优于超声30 min，故采用60 min作为超声时间。提取溶剂的选择，《中国药典》中[2]女贞子、白芍、制何首乌、淫羊藿药材的含量测定均采用50%乙醇提取，本研究也对提取溶剂单因素优化，采用40%，50%，70%，100%乙醇及相同浓度的甲醇超声比较，结果显示50%乙醇对测定的4种成分提取效率均最高，故本研究最终采用50%乙醇为溶剂超声提取(40 kHz，250 W)60 min作为提取方法。

3.3含量测定结果分析 本研究采用HPLC梯度洗脱多波长切换法同时测定了固肾丸中的4种成分含量，方法学验证结果表明该法操作简便、重复性好、准确度高。测定结果表明，3批样品中4种待测成分的平均含量从高到低依次为芍药苷(0.65～0.72 mg·g-1)、淫羊藿苷(0.35～0.56 mg·g-1)、二苯乙烯苷(0.30～0.56 mg·g-1)、红景天苷(0.19～0.36)mg·g-1，各批间4种成分的含量有明显差异，这可能与饮片的质量差异有关，为保证制剂成品的质量，中药饮片的来源应统一，质量应严格把关；结果也表明多成分测定对控制固肾丸质量的必要性。根据测定结果，按测定成分的平均含量的80%作为含量限度指标，本品中芍药苷、淫羊藿苷、二苯乙烯苷、红景天苷含量按干燥品计算须≥0.56，0.36，0.35，0.20 mg·g-1。