反相高效液相色谱法测定金沙藤中异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素的含量

张道英，陈娇婷，陶济明，陈雅丽，刘海

（赣南医学院药学院，江西 赣州 341000）

金沙藤是植物海金沙以及小叶海金沙的干燥地上部分，以夏秋植物生长旺盛时采收为佳［1-3］。本品始载于《证类本草》，有清热解毒和渗湿利小便的作用，对于尿路感染、排尿困难有很好的治疗作用，李时珍谓：“壮如蒲黄粉。其沙和草皆可入药”［4］。现如今所用的金沙藤中药材与李时珍所诉一致。

研究表明，异槲皮苷具有良好的抗高血压和抗炎作用，紫云英苷具有良好的利尿和抗炎作用［5］，槲皮素具有很好的抗痉挛、抗氧化、镇咳和平喘作用［6-7］，山奈素具有抗癌、抗癫痫、抗炎、抗氧化剂、抗溃疡作用［8-9］。有文献报道，将异槲皮苷这一成分作为研究金沙藤药材质量标准对照品的建议［10］。目前，使用反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC）法测定海金沙藤主要集中于其中的紫云英苷、异槲皮苷、咖啡酸等成分［11-12］。用单一组分测定相对于多种组分同时测定评估中药材质量有一定的弊端，因中药成分复杂，功效繁多，很难用单一某种成分评估其质量，而同时测定多种有效成分作为中药质量控制标准已成为一种趋势。本实验在前期实验HPLC法测定金沙藤中异槲皮苷和紫云英苷含量［12］的基础上继续进行深入研究，期望能用一种方法尽可能地测定金沙藤中的多种成分。本实验用正交试验来优选金沙藤的最佳制备条件，用RP-HPLC法对金沙藤中异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素的含量［13］进行测定，以建立金沙藤药材质量标准的量化指标。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂紫云英苷（纯度HPLC＞98%，规格20 mg，批号1606103，成都普菲德生物技术有限公司）；槲皮素（纯度HPLC＞98%，规格20 mg，批号：150914，成都普菲德生物技术有限公司）；异槲皮苷（纯度＞98%，规格20 mg，批号：111809-201403，中国食品药品检定研究院）；山奈素（纯度＞98%，规格20 mg，批号：111809-201405；中国食品药品检定研究院）；甲醇（HPLC级、AR）；甲酸（HPLC级）；乙醇（AR）；水（超纯水）。四种对照品的纯度符合高效液相实验使用的要求。

金沙藤药材分别购买于江西省赣州市（赣江草药店和李记草药店）、湖南长沙和四川宜宾，所有药材都经药学院生药学教研室李加林副教授鉴定为金沙藤正品。

1.2 仪器LC-15C型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；超声波清洗仪（JP-100，深圳市洁盟清洗设备有限公司）；万分之一分析天平（FA1104，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；十万分之一分析天平（Satorius，德国赛多利斯公司）；中药粉碎机（12SFS1400，合肥荣事达小家电有限公司）；恒温水浴锅（B-260，上海雅荣生化仪器设备有限公司）；药典筛（三号，浙江上虞市道墟张兴纱筛厂）；艾柯实验室超纯水机（Exceed-Ad-16，成都唐氏康宁科技发展有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱为Agilent C18柱，规格（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（B）-0.3%甲酸（A），梯度洗脱，洗脱程序见表1；柱温30℃，检测波长360 nm，流速为1.0 mL·min-1。此条件下异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素可以实现良好的分离（色谱图见图1、图2）。

图1 混合对照品溶液的HPLC图

图2 金沙藤样品溶液的HPLC图

表1 最佳的梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备取4个洁净的25 mL容量瓶，分别精密称取11.02 mg、7.33 mg、4.05 mg、5.35 mg的异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素对照品，放于其中，将其全部用甲醇（色谱纯）溶解并定容至刻度，摇匀得4种对照品溶液，异槲皮素浓度为0.440 8 mg·mL-1、紫云英苷为0.293 2 mg·mL-1、槲皮素0.162 mg·mL-1、山奈素0.214 mg·mL-1。

将上述4种溶液分别精密吸取0.5 mL、0.5 mL、0.2 mL、0.1 mL至样品瓶，并摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 线性关系考察精密吸取1 mL异槲皮苷对照品溶液（0.440 8 mg·mL-1），置10 mL容量瓶中，用甲醇（色谱纯）稀释至刻度，摇匀，分别进样（0 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL），根据色谱图结果中的峰面积（Y）对进样量（X，μg）进行线性回归，得到异槲皮苷的回归方程。

精密吸取2 mL紫云英苷对照品溶液（0.293 2 mg·mL-1），置10 mL容量瓶中，用甲醇（色谱纯）稀释至刻度，摇匀，分别进样（0 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL），基于色谱图上的峰面积（Y）对进样量（X，μg）进行线性回归，得到紫云英苷的回归方程。

精密吸取1 mL槲皮素对照品溶液（0.162 mg·mL-1），置10 mL容量瓶中，用甲醇（色谱纯）稀释至刻度，摇匀，分别进样（0 μL、1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL），基于色谱图上的峰面积（Y）对进样量（X，μg）进行线性回归，得到槲皮素的回归方程。

精密吸取1 mL山奈素对照品溶液（0.214 mg·mL-1），置10 mL容量瓶中，用甲醇（色谱纯）稀释至刻度，摇匀，分别进样（0 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL），基于色谱图上的峰面积（Y）对进样量（X，μg）进行线性回归，得到山奈素的回归方程。4种成分的线性回归方程结果见表2。

表2 金沙藤中4种成分的线性关系

2.4 供试品溶液制备方法的优选

2.4.1 单因素试验对供试品溶液制备方法的选择分别考察不同提取方法（回流提取、超声提取）、不同提取溶剂（纯甲醇、50%甲醇、75%甲醇和纯乙醇）、不同提取时间（3小时、2小时、1小时）对供试品溶液提取成分含量的影响，结果表明，供试品溶液的最佳提取条件是：精密称取过三号筛的金沙藤粉末约1.0 g，置烧瓶中，加50 mL纯甲醇，水浴回流提取2小时，为最佳提取条件。

2.4.2 正交试验优选供试品溶液的最佳提取条件根据单因素试验的结果，通过正交试验法［14］进一步研究供试品溶液的最佳提取条件，精密称定金沙藤粉末（1.003 1 g、1.003 0g、1.003 3 g、1.003 2 g、1.003 1 g、1.003 1 g、1.003 2 g、1.003 1 g、1.003 3 g），以甲醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）为考察因素，按L9（33）正交表设计实验将各实验的所得样品定容至100 mL容量瓶，进样量为10 μL进行试验，用正交软件助手3.1进行分析。结果见表3、表4。

表3 金沙藤中回流提取工艺正交试验设计

表4 正交实验法优选金沙藤提取工艺的实验设计与实验结果

对于异槲皮苷来说B＞A＞C，为了节省溶剂最佳组合是B3A3C1；紫云英苷B＞A＞C，为了节省溶剂最佳组合是B3A3C1。对于槲皮素来说最佳组合可以是A3B3C1，对于山奈素来说A=C=B，最佳组合是B3A3C1。综上所述，最好的实验方案是B3A3C1，正交实验的最佳条件B3A3C1与单因素的实验结果一致。

供试品溶液的最佳提取条件为：精密称取1.0 g过三号筛的金沙藤粉末，以50 mL的纯甲醇为溶剂，水浴回流提取2小时，过滤，即得。

2.4.3 验证试验取约1.0 g湖南长沙产的金沙藤药材3份，精密称定，并根据“2.4.2”供试品溶液的最佳提取条件进行验证试验，结果显示，提取工艺条件稳定可靠、重现性良好。验证试验结果见表5。

表5 验证实验结果

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度实验将按“2.4.2”供试品溶液的最佳提取条件得到的湖南长沙产金沙藤提取液连续进5针，进行分析，每针10 μL，通过色谱结果计算出异槲皮苷、紫云英苷峰、槲皮素、山奈素峰面积RSD值分别为1.35%、1.86%、1.50%、1.96%，可知仪器具有良好的精密度。

2.5.2 稳定性实验按“2.4.2”供试品溶液的最佳提取条件得到的湖南长沙产金沙藤提取液，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h各进1针，皆为10 μL，根据高效液相色谱结果计算得异槲皮苷峰面积、紫云英苷峰面积、槲皮素峰面积、山奈素峰面积的RSD值分别为1.25%、1.37%、1.53%、1.93%，可知金沙藤提取液在12 h内具有良好的稳定性。

2.5.3 重复性实验精密称定5份湖南长沙产的金沙藤粉末（1.003 1 g、1.003 3 g、1.003 1 g、1.003 2 g、1.003 3 g），根据“2.4.2”供试品溶液的最佳提取条件进行提取，各进样10 μL。根据高效液相色谱结果计算得到异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素的含量分别为0.103 8%、0.095 5%、0.002 2%、0.001 6%，含 量 的RSD值 分 别 为1.19%、1.43%、1.48%、1.68%，说明该方法具有较好的重复性。

2.5.4 加样回收率实验分别取适量的异槲皮苷（0.440 8 mg·mL-1）、紫云英苷（0.293 2 mg·mL-1）、槲皮素（0.162 mg·mL-1）和山奈素（0.214 mg·mL-1）对照品溶液，分别加入到5份精密称定的湖南长沙产金沙藤粉末中（每份约0.5 g），根据“2.4.2”供试品溶液的最佳提取条件进行提取，静置放冷后过滤，并全部转移至50 mL容量瓶中，用分析纯的甲醇定容至刻度，摇匀，进样分析，分别进样10 μL，得到异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素的平均加样回收率及加样回收率RSD值，结果见表6。表明本方法的准确度良好。

表6 金沙藤中4种成分的加样回收率实验结果

2.6样品测定分别取金沙藤（赣州赣江草药店、湖南长沙、赣州李记草药店、四川宜宾），按“2.4.2”供试品溶液的最佳提取条件进行提取，提取液各连进3针，每针10 μL，根据线性回归方程和色谱峰面积可以得出不同金沙藤样品中异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素的平均含量，结果见表7。

表7 不同产地金沙藤中4种成分的平均含量/%

3 讨论

3.1本实验结果表明，不同地区产的金沙藤中4种成分的含量有较大的差异，对于异槲皮苷和紫云英苷来说湖南长沙产的含量明显要高于其他产地。

3.2本实验考察了过不同筛号的金沙藤粉末对于成分含量的影响，结果显示，过2、3、4、5号筛所得结果基本一致，最后选择取过三号筛的金沙藤粉末进行实验。

3.3用纯甲醇提取金沙藤提取液，提取液注入液相仪时，如果进样量为20 μL，会产生色谱峰前沿的现象，因此，实验中测试样品的注射体积为10 μL。

3.4流动相如果用甲醇-水做流动相，会产生严重的拖尾现象，故加入甲酸来防止色谱峰的拖尾，效果良好。

4 小结

本实验选用RP-HPLC法同时测定中药金沙藤中异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素的含量，重复性好，结果稳定，操作方便，可用于金沙藤中这4种成分的含量测定，并可以为金沙藤药材质量标准的建立提供量化依据。