基于《中华人民共和国药典》优化丹参中33种禁用农药残留物检测的前处理方法

杨 红，韩玲玲，雒 昱，张亚中，，吴德玲，刘军玲，

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051；3.国家药品监督管理局中药质量研究与评价重点实验室，安徽 合肥 230051；4.岛津企业管理(中国)有限公司，上海 201108)

丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)为唇形科植物丹参的干燥根和根茎[1]，广泛分布于安徽、陕西、山东、河南及四川等地[2]，是临床常用的大宗药材之一。目前，丹参多为人工种植，在种植过程中不可避免地会使用农药防治病虫草害，从而产生农药残留的质量安全问题。近年来，中药农药残留问题日趋严重，已成为监管部门和社会群体密切关注的问题[3]。尽管2020版《中华人民共和国药典》四部对植物类中药材和饮片中33种禁用农药(包括其代谢物、异构体共54个单体)给出了通用性的检测方法，但中药材基质复杂，在提取残留农药的同时，其自身所含的相关成分如油脂、色素、有机酸也会被一同提取出来，干扰检测结果[4]，因此对其进行禁用农药残留检测依旧是实践中值得探究的课题。

样品前处理技术是农药残留分析过程中繁琐且易直接影响检测结果的重要环节[5]。丹参中主要含有酚酸类、黄酮类以及含氮类化合物等化学成分[6]，基质较为复杂。因此，笔者以丹参为研究对象，结合2020年版《中华人民共和国药典》四部中33种禁用农药残留前处理方法，从基质效应和回收率方面筛选出较为合适的前处理方法并进行优化，以期为丹参33种禁用农药残留检测提供参考。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器 TQ8040NX气相色谱三重四极杆质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer/mass spectrometer，GC-MS/MS)、LCMS-8050液相色谱三重四极杆质谱联用仪(liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometer，LC-MS/MS)：SHIMADZU公司；真空平行浓缩仪、AH-50全自动均质器：睿科集团；飞鸽牌离心机：上海安亭科学仪器厂；XW-80AO涡旋混合器：上海沪西仪器分析厂；XP205 型十万分之一电子分析天平：Mettler；Millipore Simplicity-185型超纯水仪：Millipore公司。

1.2 主要试剂与材料 33种禁用农药混合标准品(批号 610020-202001)：中国食品药品检定研究院；磷酸三苯酯对照品(批号 S060565，浓度100 μg/mL)：SHIMESEM；质谱纯乙腈：Fisher Chemical公司；色谱纯甲苯：TDEIA公司；甲酸铵、甲酸为色谱纯；冰乙酸、氯化钠为分析纯；快速样品处理法提取盐包(6 g无水MgSO4，1.5 g无水乙酸钠)；分散固相萃取净化管(无水硫酸镁900 mg，N-丙基乙二胺300 mg，十八烷基硅烷键合硅胶300 mg，硅胶300 mg，石墨化碳黑90 mg)；HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL)；石墨化碳黑氨基复合固相萃取小柱(500 mg/500 mg，6 mL)。

1.3 样品 实验用丹参样品来源于安徽省食品药品检验研究院所承担的2021年国家评价性抽验中的199批饮片和60批药材。

2 方法

2.1 检测条件

2.1.1 LC-MS/MS分析条件 色谱条件：色谱柱为Shim-pack Velox C18(2.7 μm，2.1 mm×100 mm)，柱温40 ℃；流动相：以0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L甲酸铵)为流动相A，以乙腈-0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L甲酸铵)(95∶5)为流动相B；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；梯度洗脱程序：0～1 min(30%B)，1～12 min(30%～100%B)，12～14 min(100%B)。质谱条件：电喷雾电离(electron spray ionization，ESI)离子源，正离子扫描，多反应监测(multi reaction monitoring，MRM)，33种禁用农药监测离子对及具体质谱参数除水胺硫磷(两对监测离子对分别为291.00>231.00和291.00>121.10，碰撞电压分别为15 V和40 V)外，其余质谱参数参考2020年版《中华人民共和国药典》通则“2341”第五法表7[7]。按照上述LC-MS/MS条件所得33种禁用农药混合标准溶液总离子流图见图1。

图1 LC-MS/MS法检测丹参中33种禁用农药残留物混合标准品溶液总离子流图

2.1.2 GC-MS /MS分析条件 色谱条件：色谱柱为SH-Rxi-17 MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度：250 ℃，不分流进样。载气：高纯氦气；程序升温：参考2020年版《中华人民共和国药典》四部“2341”第五法[7]；进样量：1 μL。质谱条件：电子轰击源，离子源温度：250 ℃；碰撞气：氩气；质谱传输接口温度：250 ℃；MRM，33种禁用农药及内标化合物监测离子对及具体质谱参数参考2020年版《中华人民共和国药典》通则“2341”第五法表6[7]。按照上述GC-MS/MS条件所得33种丹参中禁用农药混合标准溶液及内标化合物总离子流图见图2。

图2 GC-MS/MS法检测丹参中33种禁用农药残留物混合标准品溶液及内标总离子流图

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密量取禁用农药混合对照品溶液(具体浓度见中国食品药品检定研究院官网：http://aoc.nifdc.org.cn/sell/home/search.html)1 mL，置20 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。低温避光保存。

2.2.2 GC-MS/MS法分析用内标溶液的制备 取磷酸三苯酯对照品溶液0.1 mL，加乙腈稀释至100 mL，摇匀，得100 ng/mL磷酸三苯酯的内标溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取样品，按“2.3”项制备方法处理制成供试品溶液。

2.2.4 基质匹配标准曲线溶液的制备 取空白基质样品，按“2.2.3”节的制备方法处理制成空白基质溶液。分别精密量取空白基质溶液1.0 mL(6份)，置真空平行浓缩仪上，40 ℃水浴浓缩至0.6 mL，分别加入混合对照品溶液10、20、50、100、150、200 μL，加乙腈稀释至1 mL，涡旋混匀，即得。

2.3 样品前处理方法

2.3.1 2020年版《中华人民共和国药典》方法 包括3大类前处理方法：①直接提取法；②快速样品处理法(quick，easy，cheap，effective，rugged and safe，QuEChERS)；③固相萃取法(固相萃取方式一；固相萃取方式二；固相萃取方式三)。

2.3.2 优化QuEChERS法 将样品粉碎，过三号筛。精密称取3 g置于50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入10 mL水，再加入15 mL 1 %冰醋酸溶液，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，涡旋混匀，置振荡器上以每分钟500次的频率剧烈振荡5 min，加入无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末(4∶1)7.5 g，立即摇散，再置振荡器上每分钟500次的频率剧烈振荡3 min，冰水浴10 min，离心(4 000 r/min)5 min，取上清液9 mL，置预先装有净化材料的分散固相萃取净化管[无水硫酸镁900 mg，N-丙基乙二胺300 mg，十八烷基硅烷键合硅胶300 mg，硅胶300 mg，石墨化碳黑90 mg]中，涡旋，置振荡器上每分钟500次的频率剧烈振荡5 min，离心(4 000 r/min)5 min，精密吸取上清液5 mL，置平行浓缩仪上于40 ℃水浴浓缩至约0.4 mL，加乙腈稀释至1.0 mL，涡旋混匀，滤过，取续滤液，得即。

2.4 测定法 参考2020年版《中华人民共和国药典》通则“2341”第五法中测定法进样[7]。

3 结果

3.1 2020年版《中华人民共和国药典》方法添加回收试验 取空白样品精密加入混合对照品溶液(添加水平为定量限浓度水平，定量限采用2020年版《中华人民共和国药典》通则“0212”定量限浓度)，按“2.3.1”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项检测条件和“2.4”项测定条件进样，进行回收试验，重复实验6次，计算回收率。结果发现，采用《中华人民共和国药典》3大类前处理方法时，受丹参基质严重干扰，部分农药化合物回收率较低，说明药典中的33种禁用农残方法不适用于丹参，因此需进一步优化前处理方法。

3.2 优化QuEChERS法与2020年版《中华人民共和国药典》中QuEChERS法回收率结果比较 取空白样品精密加入混合对照品溶液(添加水平为定量限浓度水平，定量限采用2020年版《中华人民共和国药典》通则“0212”定量限浓度)，按“2.3.1”和“2.3.2”项下方法分别制备供试品溶液，按“2.1”项检测条件和“2.4”项测定条件进样，进行回收试验，计算回收率。结果发现，采用优化后QuEChERS法处理样品时，丹参33种禁用农药残留物的回收率明显优于药典中QuEChERS法。见图3。

图3 两种方法检测的丹参中33种禁用农药残留物回收率比较

3.3 优化QuEChERS法的方法学考察

3.3.1 空白实验 除不加样品外，按“2.3.2”项供试品溶液制备方法制得1 mL空白溶液，按“2.1”项检测条件和“2.4”项测定条件进样分析。结果表明，实验过程和方法对33种禁用农药的分析检测均无干扰。

3.3.2 线性关系考察 将“2.2.4”项中的基质匹配标准溶液，按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项检测条件和“2.4”项测定条件进样。结果表明，在线性范围内，33种禁用农药及其相关代谢物、异构体线性良好。见表1。

3.3.3 回收率和精密度 取空白样品精密加入混合对照品溶液(添加水平为定量限浓度水平，定量限采用2020年版《中华人民共和国药典》“0212”定量限浓度)，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项检测条件和“2.4”项测定条件进样，进行回收试验，重复实验6次，计算回收率和RSD，结果见表1。

表1 线性关系考察及回收率试验结果(n=6)

3.3.4 稳定性 取空白样品，精密加入混合对照品溶液(添加水平为定量限浓度水平，定量限采用2020年版《中华人民共和国药典》通则“0212”定量限浓度)，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项检测条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，按“2.4”项测定条件计算各个目标农药的回收率，计算RSD值。结果显示，各个目标农药回收率的RSD值为2.14%～14.58%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.4 样品检测 以优化后的QuEChERS法对2021年国家评价性抽验的丹参样品中199批饮片和60批药材进行检测。结果发现，样品中共检出2种农药，甲拌磷检出率为3.86%，克百威检出率为1.93%，但残留量均未超过2020年版《中华人民共和国药典》限度规定。

4 讨论

4.1 《中华人民共和国药典》前处理方法的比较

4.1.1 基质效应的比较 基质效应是指样品基质中的某些共流出组分会影响待测物测定结果的准确性和重复性[8]。在GC-MS/MS分析中，农药多表现为基质增强效应，通常认为是待分析农药与硅醇基及其与玻璃衬管表面金属离子间的相互作用所致。在LC-MS/MS分析中，农药多表现为基质抑制效应，通常认为是由基质干扰成分与目标化合物在ESI进行离子化时相互竞争造成[9-10]。

本研究以农药在空白基质中的信号峰面积与在溶剂标准溶液中的信号峰面积比值计算基质效应，若比值<80%，则认为存在弱基质抑制效应；若比值为80%～120%时则认为没有基质效应；若比值>120%，则认为存在强基质增强效应[11-12]。本研究比较了2020年版《中华人民共和国药典》中禁用农药残留检测3类前处理方法(即直接提取法、QuEChERS法和固相萃取法)的基质效应，发现采用QuEChER法时，在LC-MS/MS和GC-MS/MS分析中，分别有26.7%和40%的农药没有基质效应。与其余两类前处理方法相比，QuEChERS法的基质效应较小。

4.1.2 《中华人民共和国药典》前处理方法对回收率结果的比较 本实验考察了2020年版《中华人民共和国药典》中禁用农药残留检测3类前处理方法对回收率结果的影响。结果发现，当采取固相萃取方式一和固相萃取方式三为样品前处理方法时，由于磺隆类农药为酸性农药，上述两种方法中净化填料N-丙基乙二胺和氨基会对其产生严重吸附，导致其回收率极低；除此之外，发现部分有机磷类农药(苯线磷、甲拌磷、特丁硫磷、内吸磷及其相关代谢物或异构体)受丹参基质影响，《中华人民共和国药典》3类前处理方法回收率均未能满足《中华人民共和国药典》规定。同时，研究发现采用QuEChERS时，33种禁用农药化合物的回收率为60%～130%时分布的个数最多，占总数的94.44%。

在实际样品分析中，丹参中存在大量色素，会污染检测仪器，干扰检测结果，增加仪器维护成本。综合考虑基质效应、仪器维护成本和回收率结果，QuEChERS法较为适于作为丹参33种禁用农药残留的前处理方法。但其中部分农药回收率无法达到检测要求，故该方法需进一步优化。

4.2 前处理方法的优化

4.2.1 样品中水的加入量的考察 QuEChERS法可测定高含水量(80%～95%)样品中的农药，如蔬菜、水果类[13-15]。而中药材含水量低，样品与农药结合紧密，必须添加一定量的水，使样品充分溶胀，以提高提取效率[16-17]。因此，本实验在药典QuEChERS法的基础上，考察加水量分别为5、10、15 mL时禁用农药回收率的变化。结果发现，在一定范围内，增加水的用量，会显著提高高极性农药的回收率，但当水的容积为15 mL时，其对目标农药的提取效率增加不明显，故试验组选择加水量为10 mL。

4.2.2 浸泡时间的考察 本实验将样品加入10 mL水，涡旋混匀后，分别静置5、15、30 min后，考察浸泡时间对农药回收率的影响。结果发现，加水后不同浸泡时间下的回收率没有显著差异，说明样品加入水直接加入1%冰醋酸浸泡30 min可使样品充分溶胀，故最终确定加入10 mL水后无需浸泡，再按照QuEChERS法进行样品前处理。

农药不仅影响中药材及其产品的质量和安全性，也影响其在国际市场的竞争力。本研究从基质效应和回收率方面比较《中华人民共和国药典》3类前处理方法，最终对QuEChERS法进行优化。优化后的QuEChERS法快速简便，回收率良好，有针对性地对丹参中33种禁用农药残留进行了准确检测。