信号转导子和转录激活子 3与 B细胞淋巴瘤-2在前列腺癌中的表达及其相关性

谢柠骏，蔡运林，伍季，张宗平，李云祥

(川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院泌尿外科，四川 南充 637000 )

前列腺癌是一种高度恶性的男性泌尿系肿瘤，近年来，随着中国生活水平的改善，该疾病呈快速上升趋势，尤其是在发达地区[1]。癌症发生发展与凋亡成分的失调密不可分，而细胞凋亡依赖于不同信号通路的激活，但此类信号通路在癌症中经常失调[2]。 B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2 gene，Bcl-2)家族成员具有同源性结构域，决定细胞的促凋亡或抗凋亡功能[3]，其表达水平与前列腺癌发病风险和临床病理特征相关，但当前研究的结论不甚一致[4]，具体机制仍待探索。信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)对许多原发性人类上皮肿瘤和癌细胞系中有显著的促进与维持作用[5]，目前被认为是潜在的预防、治疗肿瘤的重要靶点，尤其是在前列腺癌中发现有持续活化的STAT3表达[6]。但针对 STAT3与前列腺癌发生进展的关系迄今未见一致的报道，STAT3介导前列腺癌发生发展的具体作用机制尚未明确，且前列腺癌组织中Bcl-2与STAT3表达之间是否存在相关性未见报道。因此，本研究拟探讨STAT3和Bcl-2 蛋白表达水平与前列腺癌的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年10月4日至2021年11月8日南充市中心医院收治的男性前列腺患者48例，按照病变情况不同分为前列腺癌组(n=27)和前列腺增生组(n=21)。前列腺癌病例组中，年龄61～83岁，<75岁14例，≥75岁13例，平均(73.3±4.33)岁；前列腺增生病例组中，年龄58～82岁，<75岁有10例，≥75岁有11例，平均(74±5.18)岁。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

同期搜集所有患者的血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)水平， 共有3例PSA <10,10例PSA值=10～20,14例PSA>20。前列腺癌组的临床分期[7]根据美国癌症联合委员会肿瘤分期手册第8版(AJCC Cancer Staging Manual,Eighth Edition ，2017)分别分为Ⅱ期(4例)、Ⅲ期(10例)、Ⅳ期(13例)，病理分级根据Gleason评分<7分，=7分，>7分分为高分化(4例)、中分化(7例)、低分化(16例)，所有患者术前均未行放疗、化疗。

纳入标准：(1)均符合前列腺取材标准[8]，且通过病理检测确诊为前列腺癌、前列腺增生；(2)均行前列腺根治手术且术前未进行放化疗；(3)临床及随访资料完整。排除标准：(1)非首次前列腺癌就诊；(2)合并有免疫疾病、糖尿病、高血压等其他基础疾病；(3)其他恶性肿瘤患者。

1.2 试剂

免疫组化：Bcl-2、STAT3一抗均购自ABclonal 公司，所用的免疫组化检测试剂盒、二抗及DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司。

免疫荧光：Bcl-2、STAT3一抗均购自ABclonal 公司，正常山羊血清、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司，二抗(FITC标记山羊抗兔)为Servicebio公司产品。

1.3 免疫组化实验步骤及计数规则

采用石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，应用双氧水阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，再分别孵育一抗和二抗，然后用二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，最后通过复染、脱水、封片。应用显微摄像系统对切片进行图像采集。每个切片随机选取5个≥100个细胞的视野进行观察，取其平均值。采用双盲法，由两位高年资病理科医生对同一组织切片进行结果判定。评判标准参照2019年免疫组织化学检测技术共识：基本无着色为阴性(-)；≤10%的细胞不同强度着色为弱阳性(+)；10%～30%的细胞呈强的棕褐着色，或≤70%的细胞呈现弱或中等强度的着色为阳性(++)；>30%的细胞呈现强的棕褐着色或>70%的中等强度着色为强阳性(+++)。

1.4 免疫荧光步骤

采用石蜡切片脱蜡至水，抗原修复后分别孵育一抗和二抗、滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次、使用抗荧光衰减封片剂封片。每张切片随机采集3个视野，采用Image-J图像分析系统测定所采集全部图像的荧光强度取平均荧光强度，再使用3张图像的平均荧光强度取平均数为最终每例样本的平均荧光强度。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 STAT3及Bcl-2在两组组织中的表达

免疫组织化学检测结果：STAT3表达主要存在于胞浆与细胞核，呈棕黄色至棕褐色。STAT3在前列腺增生组织及前列腺癌组织中的表达阳性率分别为33.3%、96.3%，在前列腺增生组织中STAT3表达为阴性或弱阳性，而在前列腺癌组织中表达为阳性，随肿瘤临床分期增加，表达强度逐渐增强，两组差异有统计学意义(P<0.05)。Bcl-2表达位于细胞质，Bcl-2在前列腺增生组织中表达为阴性或弱阳性，在前列腺癌组织中表达为阳性，随肿瘤临床分期增加，表达强度逐渐增强。Bcl-2在前列腺增生及前列腺癌组织中阳性率分别为28.6%、96.3%，两组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1及图2。

免疫荧光染色结果：DAPI染细胞核为蓝色， Bcl-2、STAT3显出的阳性表达为绿色，STAT3免疫荧光应用二抗(FITC标记山羊抗兔)显色。STAT3在前列腺癌组织中表达强，荧光亮度亮，复染后可见其分布在细胞核与间质组织。而在前列腺增生组织中STAT3表达较弱，复染后见荧光亮度暗淡。STAT3在前列腺增生组织中的荧光强度与前列腺癌中的荧光强度差异有统计学意义(P<0.05)。 Bcl-2在前列腺癌组织中呈强表达，绿色荧光明亮耀眼，而在前列腺增生组织中， Bcl-2荧光较暗。复染后，细胞核在前列腺癌组织核周围的胞浆表达较强，前列腺增生组织中在细胞核之间有微弱分布，二者荧光强度差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3、图4及表2。

表1 STAT3及Bcl-2在前列腺增生及前列腺癌组织中的表达 [n(%)]

表2 STAT3、Bcl-2在两组中的免疫荧光强度

2.2 STAT3和Bcl-2表达与PSA、前列腺癌临床病理参数关系及相关性

STAT3与Bcl-2在前列腺癌组织中表达均与年龄无关(P>0.05)，二者与病理分级、PSA值、临床分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)，且低分化(Gleason评分>7)、临床分期为Ⅲ + Ⅳ期的前列腺癌患者的 Bcl-2 和 STAT3 阳性表达率较高(P<0.05)，前列腺癌组织中STAT3与Bcl-2 表达正相关(r=0.685，P<0.001)。见表3及表4。

表3 STAT3、Bcl-2与临床病理参数的关系[n(%)]

表4 STAT3与Bcl-2在前列腺癌组织中的相关性

3 讨论

转录信号传导子与激活因子蛋白家族(STAT)是细胞因子信号传导和干扰素相关的抗病毒活动中的关键蛋白。其中STAT3主要存在于细胞胞浆，在激活后单体聚合以二聚体，四聚体等多聚体形式转入核内与DNA结合，与相应的靶基因启动子结合而激活相应的基因转录和表达[9-12]。正常生理状态下，STAT3通常只会暂时地被激活，在异常情况中如恶性肿瘤中，STAT3可能过度表达、持续激活，作用于多个靶点以完成多种生物学活动[13]，如Tolomeo等[14]报道STAT3过度激活促进了人类骨髓瘤细胞的生长。本研究中，在前列腺癌组织中STAT3的表达显著高于前列腺增生组织，且随着临床分期、病理分级、Gleason评分、PSA的升高，STAT3蛋白的表达率也在逐步上升，提示STAT3可能与前列腺癌的进展和分化、预后有关。

细胞凋亡主要由外在和内在凋亡途径控制，其中内在凋亡途径主要由 Bcl-2家族蛋白质介导，其功能的异常已经在许多疾病中得到证实，包括癌症、神经退行性疾病、缺血和自身免疫性疾病[15]。既往研究[16-18]显示，前列腺癌组织中 Bcl-2阳性率明显高于前列腺增生组织，与临床、病理指标及生存率存在相关性，提示 Bcl-2可能参与了前列腺癌的发生发展，与前列腺癌的鉴别和临床预后相关。本研究中， Bcl-2在前列腺癌组织中的表达高于前列腺增生组织，且其表达水平与临床分期、病理分型、Gleason评分和PSA值正相关，提示 Bcl-2过表达促进前列腺癌的发生与发展。

Bcl-2是抗凋亡家族成员，某些过表达 Bcl-2的细胞，可能会积累进一步的遗传损伤，从而推进肿瘤转化。Strasser等[19]指出细胞凋亡若被抑制，会使细胞积聚，从而阻止DNA受损的细胞被清除使得肿瘤发生，增加恶性细胞对药物的抵抗力。本研究发现前列腺癌组织中STAT3与 Bcl-2 表达正相关，这可能是由于STAT3驱动肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[20]， Bcl-2抑制细胞凋亡， Bcl-2与STAT3的协同作用共同促进前列腺癌的发展与分化，这一过程可能与微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)的缺失相关[21]。基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析显示miR-15a在前列腺癌组织中表达异常，而且在非裔美国人和高加索人以及亚洲人群之间表达有统计学差异，STAT3以及 Bcl-2均可能是miR-15a-3p的调控靶点。杨登科等[22]研究表明miR-15a在前列腺癌患者血清中的表达水平明显下降，且与肿瘤的病理分期 、组织学分级有关。 Bcl-2基因3′-非翻译区(3′-UTR)的核苷酸序列与miR-15a存在互补的结合位点，miR-15a 通过作用于 Bcl-2 mRNA的3′-UTR的特定序列，抑制蛋白的翻译过程，进而影响细胞的凋亡[23-24]。此外，本研究结果显示前列腺癌患者肿瘤组织中的Bcl-2的表达与PSA表达水平、Gleason评分、临床分期之间差异有统计学意义。提示miR-15a可能参与了前列腺癌的发生、发展过程，是前列腺癌辅助诊断及治疗的潜在的指标。因此，针对miRNA及其相应的靶点研究相应的抑制剂或促进剂，提供新的诊断或治疗方案，可能是一种积极有效的抗癌治疗方法。但本研究样本量较小，未纳入癌旁组织标本进行检测，存在一定的局限性，并且STAT3与 Bcl-2之间相互作用关系及生物学功能方面的研究较少，因此STAT3与 Bcl-2在前列腺癌中的相互作用机制还有待进一步研究。

综上，STAT3与Bcl-2在前列腺癌组织中的表达均高于在前列腺增生组织中的表达，且随着病理分级和临床分期的上升，两者的表达也逐渐升高，STAT3与 Bcl-2之间呈正相关关系。