肿瘤相关成纤维细胞对于免疫细胞的调节作用研究现状

慕广 张文豪 黄晶晶 陈志鹏 王俊

已有的研究[1]发现，肿瘤的发生发展不仅取决于肿瘤细胞本身，还与肿瘤细胞所处的环境即肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）密切相关。TME主要由血管、肿瘤相关成纤维细胞（cancer‐associated fibroblasts, CAFs）、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）和浸润性免疫细胞组成[2]。其中，CAFs是一类异质群体，是肿瘤细胞外最主要的基质成分，可以分泌多种细胞因子对肿瘤细胞的发生发展进行调控[3]。微环境中的免疫细胞主要包括肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs）、肿瘤相关巨噬细胞（tumor‐associated macrophages, TAM）、树突状细胞（dendritic cells, DCs）、骨髓来源的抑制性细胞（myeloid‐derived suppressor cells, MDSCs）和自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）等，它们对于肿瘤的生物学行为同样有着重要的调控作用。本文主要总结了近年来关于CAFs对于微环境中免疫细胞的调节作用的研究成果，强调了它们在肿瘤进展和免疫逃逸中的协同作用，以期发现影响肿瘤进展的新型分子靶点和通路。

1 CAFs的起源和异质性

成纤维细胞是间质中最丰富的细胞类型之一[4]。我们把TME中被激活的成纤维细胞称之为CAFs[5]。尽管对于CAFs已经有大量的研究，但是有关其起源的多重性，目前仍在讨论中。组织驻留成纤维细胞是CAFs的主要来源之一[6,7]。肿瘤细胞分泌的转化生长因子‐β（transforming growth factor‐β, TGF‐β）、血小板来源的生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）和成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2, FGF‐2）、基质衍生因子‐1（stromal cell‐derived factor 1, SDF‐1）等可以激活组织成纤维细胞[8‐10]。当然，由于肿瘤种类的不同，其分泌的调控因子也不相同。有研究[11,12]表明，静止状态的胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells, PSCs）和肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）在TGF‐β和PDGF的激活下表达α‐平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin, α‐SMA），α‐SMA反作用于PSCs和HSCs，将其激活为CAFs。另外，胰岛素样生长因子1（insulin‐like growth factor 1, IGF‐1）也可以对HSCs有激活作用[13]。CAFs还可以来源于骨髓，有研究[14]表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchystem cells, BM‐MSCs）在TGF‐β1的介导下分化为不同的CAFs亚群。髓源性MSCs分化为CAFs后，可以表达α‐SMA和成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）[15]。有研究[16]发现，TGF‐β1可促进增殖的内皮细胞表型转化为成纤维细胞样细胞。TGF‐β1能够诱导成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblast specific protein‐1, FSP1）和SMA等间充质标志物的表达刺激内皮细胞向间充质细胞转变（endothelial‐mesenchymal transition, EndMT）。此外，也有研究[17‐25]表明，脂肪细胞、上皮细胞、周细胞、平滑肌细胞也可以转化为CAFs。CAFs的多重起源理论在某种程度上解释了其异质性的原因。近年来有学者[26]在胰腺癌中发现了两个对立的CAFs亚型：肌成纤维细胞性CAFs（myofibroblastic CAFs, myCAFs）和炎性CAFs（inflammatory CAFs, iCAFs）。myCAFs位于癌细胞附近，可以大量表达α‐SMA，而iCAFs离肿瘤细胞较远，表达α‐SMA较少，但分泌较多的白介素（interleukin,IL）‐6和其他炎症因子［如IL‐8、IL‐11和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）］，可能通过刺激STAT3信号通路参与免疫抑制[27]。在三阴型乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）中，根据不同的成纤维细胞标志物，将CAFs分为4个亚群（S1‐S4）[28]。激活标志物的差异表达主要包括α‐SMA、FAP、血小板来源的生长因子受体β（platelet‐derived growth factor receptor β, PDGFRβ）、成纤维细胞特异性蛋白‐1（fibroblast specific protein‐1, FSP‐1）、caveolin 1（CAV‐1）和CD29。所有CAF亚型均有较低的CAV‐1水平。CAF‐S1亚群主要表达这6种标志物，其中FAP和α‐SMA高表达；CAF‐S2亚群表达6种标志物的低水平；CAF‐S3亚群α‐SMA和FAP均为阴性，但其余4个标志物均为阳性；CAF‐S4亚群无FAP，但α‐SMA和CD29较高。在定位方面，CAF‐S1和CAF‐S4主要出现在TNBC肿瘤中，人类表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor‐2, HER2）+ 肿瘤中附加CAF‐S4。CAF‐S3在HER2+和TNBC肿瘤中具有肿瘤旁定位。最后，CAF‐S2既存在于肿瘤区，也存在于肿瘤旁区，主要存在于腔内A亚型[28]。CAF‐S1亚群刺激Treg细胞的分化、募集和活化，从而促进肿瘤免疫抑制，还可以分泌CXCL12和TGF‐β，促进癌细胞迁移[28,29]。CAF‐S4亚群则通过NOTCH通路促进肿瘤细胞迁移和侵袭[30]。观察表明，微环境中可能存在pCAFs（cancer‐promoting CAFs）和rCAFs（cancer‐restraining CAFs）两种不同的群体[31]。pCAFs主要通过表达FAP‐α或α‐SMA多种途径抑制抗肿瘤免疫[32,33]，而rCAFs广泛分布于结肠癌、膀胱癌、肠癌等各种肿瘤中[34‐36]。有研究[37]发现，rCAFs可以抑制肿瘤的生长，而Meflin是一种以糖基磷脂酰肌醇为锚定的蛋白，可以作为rCAFs抑制胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）进展的标志。目前，由于缺乏特异性标志物来识别不同的CAFs，这为我们进一步了解CAFs的异质性增添了不少困难。

2 CAFs对TILs的调节作用

TILs被认为是对特异性免疫应答具有高度反应性的细胞亚群，主要由CD4+T细胞和CD8+T细胞两大细胞亚群构成[38]。CD4+T细胞主要分为Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg细胞[39]。活化的Th1细胞释放IL‐2、干扰素γ（interferon‐γ, IFN‐γ）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor‐α, TNF‐α）等细胞因子，通过介导细胞免疫诱导肿瘤细胞的凋亡；而活化的Th2细胞释放IL‐4、IL‐5、IL‐10和IL‐13等细胞因子，通过介导体液免疫发挥促进肿瘤生长的作用[40]。CAFs在被TNF‐α和IL‐1β激活后，分泌胸腺基质淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin, TSLP），通过调节骨髓状DCs，促进Th2的极化。在原发性肿瘤中，使用FAP+CAFs DNA疫苗可以显著增加IL‐2、IL‐7 Th1细胞因子的表达，同时还可以显著诱导TME中IL‐4、IL‐6 Th2细胞因子的减少，从而增加细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）的杀伤力[41,42]。Treg细胞是一类调节性T细胞，可以分泌IL‐4、IL‐10及TGF‐β等细胞因子产生免疫抑制，促进肿瘤的发展[43]。CAFs在肺癌中表达的环加氧酶2会导致其分泌前列腺素E2，而前列腺素E2可诱导FOXp3的表达，FOXp3是Treg的重要标记，在Treg细胞功能中发挥重要作用[44]。有研究[28]表明，CAF‐S1通过分泌CXCL‐12吸引CD4+CD25+T淋巴细胞，并被OX40L、程序性细胞死亡蛋白1配体2（programmed cell death 1 ligand 2, PD‐L2）和JAM2保留。此外，CAF‐S1还可增加T淋巴细胞存活率，并通过B7H3、CD73和DPP4促进其分化为CD25（high）FOXP（high）Treg。有学者[45]发现CD73+γδTregs是乳腺癌中主要的浸润性T细胞，并且比CD4+T细胞和CD8+T细胞有着更强大的免疫抑制效应。他们进一步发现了CAFs分泌IL‐6，并通过IL‐6/STAT3通路诱导CD73+γδTregs分化以及产生更多的腺苷，从而形成了强大的肿瘤免疫抑制功能。接着，他们又证明了CD73+γδTregs可以通过腺苷/A2BR/p38MAPK信号通路反向促进CAFs分泌IL‐6，形成IL‐6‐腺苷正反馈回路。CAFs通过释放IL‐1β激活核因子κB（nuclear factor κB, NF‐κB）来诱导CCL‐22 mRNA的表达，而FOXp3的表达又和CCL‐22呈正相关。可见，IL‐1β‐CCL22‐CCR4轴会促进细胞转化和Treg浸润，从而引起肿瘤的免疫抑制[46]。在肺癌微环境中，大多数CD8+T细胞经活化后转变为CTL发挥肿瘤杀伤作用[47]。有实验[48]证明，当CAFs数量较低时，瘤内和瘤周均有大量的CD8+TILs存在；当CAFs数量较多时，尽管瘤周CD8+TIL依然较多，但瘤内的数量显著减少。与之相反，CAFs较多时，瘤内FOXp3+TILs较多。这表明CAFs可能通过调节TIL的迁移，实现免疫抑制。进一步研究显示，CAFs抑制CD8+TIL向瘤内浸润，而促进FOXp3+TIL瘤内浸润。近年来也发现CAFs参与抗原交叉提呈过程，通过PD‐L2和Fas配体介导的抗原特异、抗原依赖途径杀伤CD8+T淋巴细胞，从而使肿瘤细胞逃脱免疫系统的攻击。有研究[49]发现，在胰腺导管腺癌中存在一类表达主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）II类和CD74的新CAF亚群——apCAFs（antigen‐presenting CAFs），研究证明从原位肿瘤分离的apCAFs具有在共培养的T细胞中显示出诱导CD25和CD69的能力。CAFs利用肿瘤抗原交叉呈递和关键免疫检查点配体的同步上调，驱动抗原特异性T细胞死亡和细胞毒性T细胞的功能损伤，使肿瘤细胞逃避免疫攻击。有学者[50]发现，CAFs分泌的TNF‐β可以诱导CD8+T细胞表达FOXP3，促进其向CD8+Treg细胞转化。CAFs通过IL‐6调节TME中免疫抑制TIL数量。当IL‐6的产生被阻断时，可改善已有的肿瘤免疫，提高常规免疫治疗的疗效。

3 CAFs对MDSCs的调节作用

MDSCs是一种异质细胞群，可强烈抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性并刺激Treg细胞，导致肿瘤进展[51]。CAFs可通过SDF‐1a/CXCR4途径趋化单核细胞，并通过IL‐6介导的STAT3激活诱导单核细胞分化为MDSCs。这些MDSCs以STAT3依赖的方式抑制T细胞增殖，改变T细胞的表型和功能，上调IL‐10，下调IFN‐γ，诱导Treg分化和T细胞凋亡[52]。基于这些发现，未来可以考虑把IL‐6和GM‐CSF作为肿瘤患者MDSC诱导抑制的治疗靶点。有研究[53]表明，CAFs与肿瘤细胞共培养时，会上调CCL7、CXCL1、CXCL2、CXCL8的表达水平，这些趋化因子会进一步促进MDSCs的募集。肿瘤细胞可产生集落刺激因子1（colony‐stimulating factor 1, CSF1），CSF1是一种负调控趋化因子，通过CAF将PMN‐MDSC募集到肿瘤部位，从而促进免疫抑制[54]。也有学者[55]发现通过抑制吲哚胺‐2,3‐双加氧酶1（indoleamine 2,3‐dioxygenase1, IDO1）和NADPH氧化酶NOX2和NOX4，从而减少CAFs诱导的MDSCs中活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生，进而恢复CD8+T细胞的增殖，清除ROS破坏了CAFs‐MDSCs轴，为逆转CAFs介导的免疫抑制微环境提供了潜在的治疗途径。但是如何有效清除微环境中过多的ROS以维持氧化还原平衡，改善CD8+T细胞的功能，值得进一步研究。

4 CAFs对TAMs的调节作用

TAMs是NSCLC免疫浸润的重要成分，具有高度可塑性并表现出多种表型，包括M1型（经典激活，抗肿瘤活性的促炎性反应）和M2型（非经典激活，促血管生成和原始肿瘤活性的免疫抑制）[56]。有研究[57‐59]显示，CAFs可能通过细胞因子MCP‐1和SDF‐1的介导实现对单核细胞的募集。研究人员分别通过阻断MCP‐1或SDF‐1受体（CXCR4），抑制MCP‐1或SDF‐1活性，结果显示单核细胞的迁移能力降低。研究发现，虽然SDF‐1和MCP‐1都与CAF和乳腺癌细胞介导的单核细胞招募相关；SDF‐1似乎在CAFs诱导的单核细胞招募中更为重要，而MCP‐1在乳腺癌细胞介导的单核细胞迁移中更为突出。该研究团队还证明没有肿瘤细胞的存在，CAFs也能够自行诱导PD‐1+ TAM表型，在诱导PD‐1表达方面，CAFs与肿瘤细胞一样有效[57]。有研究[60]发现，肿瘤细胞可以分泌IL‐6和GM‐CSF，刺激CAFs激活，而激活的CAFs又可以进一步促进单核细胞向M2分化。当使用IL‐6抗体和GM‐CSF抗体时，可以观察到肿瘤重量的降低，降低了肿瘤的发生，这也进一步印证了其观点。此外，CAFs可诱导IL‐6、IL‐8、TGF‐β、IL‐10等募集单核细胞并向M2型巨噬细胞分化。经CAFs培养的M1巨噬细胞M2标志物表达增加，抗炎细胞因子IL‐10的产生增加，而促炎症细胞因子IL‐12的产生减少；提示CAFs也能诱导M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转分化[60]。Cohen等[61]证实，Chi3L1在从乳腺肿瘤和转基因小鼠肺转移瘤分离的CAFs以及人乳腺癌间质中高度上调。体内成纤维细胞内的Chi3L1基因消融可降低肿瘤生长、巨噬细胞募集和向M2样表型的重编程，增强CD8+和CD4+T细胞对肿瘤的浸润，并促进Th1表型的转化。同样，M2巨噬细胞与CAFs的关系是相互的，M2巨噬细胞也能够影响成纤维细胞的间充质‐间充质转化，导致其反应性增强[62]。尽管有大量研究表明，肿瘤细胞CAFs和TAMs之间通过分泌各种细胞因子相互调控，但是由于细胞因子网络的复杂性，具体的机制尚未完全揭示，这为我们的研究提供了方向，也为治疗提供了靶点。

5 CAFs对DCs的调节作用

DCs是有效的抗原呈递细胞，能够通过I类和II类MHC复合物、共刺激分子和黏附分子的表达启动初级免疫反应，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节，在诱导抗肺癌免疫应答中起重要作用[63]。有研究[64]表明，色氨酸的代谢产物Kyn是一种重要的微环境因子，可以抑制DCs的分化，诱导癌症生长和迁移。而CAFs可以表达IDO或色氨酸‐2,3‐双加氧酶（recombinant tryptophan‐2,3‐dioxygenase, TDO）对色氨酸进行分解代谢，产生更多的Kyn，进而抑制DC功能，促进肿瘤免疫。关于CAFs对于色氨酸代谢的影响，还有待于进一步的探究，这也为我们提供了一个新的治疗靶点。有研究[65]发现，来源于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的CAFs可以促进调节性DC的生成，其特征是共刺激分子的低表达、高抑制性细胞因子的产生和免疫反应的增强调节，包括T细胞增殖障碍和通过IDO上调促进调节性T细胞（Treg）扩增。该研究还发现，当使用STAT3特异性抑制剂时，肝脏CAFs‐DC中的IDO生成显著下调，提示肝脏CAFs‐DC分泌IDO是由激活的STAT3介导。进一步研究发现，肝细胞癌来源的CAFs能够通过IL‐6介导的STAT3激活将正常DC转化为IDO产生细胞，从而形成肿瘤的免疫抑制。有学者[66]尝试将DCs与CAFs融合，发现DC/CAF融合细胞激活的T细胞在体外可以产生强烈的CTL反应。DC/CAFs融合比未成熟DCs表达更高水平的共刺激CD80、CD86和MHC II分子，实验研究表明 DC/CAF融合细胞免疫可显著降低H22肿瘤的生长并延长BALB/C荷瘤小鼠的存活时间。这些结果表明DC/CAF融合细胞作为一种新型抗肿瘤疫苗具有刺激T细胞的潜力。

6 CAFs对肿瘤NK细胞的调节作用

NK细胞通过直接识别并杀伤肿瘤细胞在抗肿瘤免疫中发挥关键作用[67]。自然杀伤组2成员D（natural killer group 2 member D receptor, NKG2D）是NK细胞的激活受体之一，对NK细胞的激活至关重要。NKG2D的两个配体MICA/B可以在肿瘤细胞表面表达。有研究[68]显示，黑色素瘤微环境中CAF增加基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）的分泌可降低MICA/B的表达，从而进一步降低NK细胞对依赖NKG2D的黑色素瘤癌细胞的细胞毒性活性。CAFs还可通过分泌前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）和/或IDO降低NK细胞表面几种NK激活受体（包括NKp30、NKp44和NKG2D）的表达，从而降低NK细胞对肿瘤靶细胞的杀伤活性[69]。CAFs的细胞表面可以表达脊髓灰质炎病毒受体（poliovirus receptor, PVR），PVR是NK激活受体DNAX辅助分子‐1（DNAM‐1）的重要配体，流式细胞术发现相对于正常成纤维细胞，PVR在CAFs细胞表面表达降低，使用抗PVR的siRNA（PVRsi）来下调NEF中PVR的表达，与PVRsi转染的正常成纤维细胞共培养的NK细胞杀伤活性下降到对照转染正常成纤维细胞的大约1/3。PVR表达的降低和对NK细胞活性的影响与CAFs大致相当。这些数据提示PVR在CAFs中的表达降低是CAFs诱导的NK细胞活性抑制的关键。CAFs可产生TGF‐β从而抑制NK细胞IFN‐γ的表达，进而阻碍Th1的分化和抑制NK细胞活化受体如NKG2D、NKp6、NKp44和NKp30的表达[70]。尽管CAFs对于NK细胞的作用已经做了很多研究，但是对于两者的相互作用以及NK细胞反向对于CAFs的调节机制，还有待于进一步发现。

7 总结与展望

CAFs和肿瘤浸润性免疫细胞是微环境中关键的组成成分，二者对于肿瘤的发生发展起到了不可或缺的调控作用。在本文中，我们着重讨论了CAFs对于TILs、TAMs、DCs、MDSCs和NKs的调控作用，并对未来可能的研究方向和治疗靶点进行了展望。CAFs可以分泌多种细胞因子以及通过多种通路实现对于肿瘤细胞、免疫细胞的调控。三者之间，形成了复杂的信息网络，共同促进肿瘤的发生发展，尽管相关的研究越来越多，但是三者之间的复杂关系仍然等待着进一步的揭示。近年来，有人通过使用纳米颗粒增强计算机扫描成像的方法，来探究微环境中免疫细胞的变化，以此评估免疫治疗的效果[71]。受此启发，考虑是否未来可以采用类似的方法来研究微环境中三者的作用关系。在治疗方面，由于通路很多，如何选择一个合适的通路来保证治疗的有效性，是一个值得考虑的方向。此外，CAFs是一个异质性群体，不同的CAFs亚群在肿瘤的免疫调控方面也有着不同的作用，如何区分不同亚型以及其各自的免疫调控机制，也期待着我们进一步的研究。