黄果百香果茎段愈伤组织培养脱毒及脱毒苗快繁体系建立

周美玲，曾 军*，张志勇，蔡建荣，江 巍，张文斌

（1.龙岩市农业科学研究所，福建 龙岩 364000；2.龙岩市新罗区良种繁育场，福建 龙岩 364000）

0 引言

百香果，学名西番莲，系西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora）的一种攀缘木质藤本植物，原产于南美洲巴西等地，在我国主要分布于广东、福建、广西、云南、浙江等地［1-3］。近年来，随着国内百香果的种植面积逐年增大，市场对种苗的需求量也越来越大。然而，目前以扦插、嫁接、实生苗繁殖为主的百香果种苗普遍存在质量参差不齐、苗木带病毒等问题，制约了百香果产业的进一步发展。现发现危害侵染百香果的病毒共有26种［4］，田间症状主要表现为叶片花叶、环斑、皱缩、坏死、黄叶、畸形、死顶、果实畸形、木质化等，植株发病率一般在30%～40%，严重的达90%以上。因此亟须开展百香果无病毒优质种苗的繁育技术研究，从源头上控制病毒病的发生危害，确保百香果产业的持续健康发展。

目前，培育无病毒植物苗木的方法通常是茎尖组织培养技术。茎尖培养可以从植物组织中脱除病毒，形成无病毒植株。茎尖大小对成活率和脱毒率具有很大的影响，茎尖越大，分化率和成活率越大，但脱毒率越低；茎尖越小，虽然脱毒率提高，但分化率和成活率又大大降低，易造成外植体死亡，导致组织培养脱毒失败［5］。因分生组织中不存在病毒，可采用成熟组织作为外植体，诱导其产生愈伤组织，通过提取其中的部分分生组织，培育出由分生组织分化的脱毒苗木。该方法在脱除植物病毒方面具有明显优势：（1）操作极为方便，无须借助体视显微镜。（2）分化率和成活率更高。传统茎尖培养的脱毒苗，由于外植体太小，外植体分化为组培苗的难度较大，接种后的外植体易死亡，导致成苗率较低。采用成熟组织作为外植体，分化率和成活率相对更高。（3）采用成熟组织作为外植体，即使生成的脱毒苗较少，也可以通过组织培养技术进行快速繁殖，不影响脱毒培养［6］。

近年来，国内在百香果离体再生体系研究方面取得了一定的进展，主要以子叶、下胚轴、茎段、胚乳、子房、根、腋芽、卷须等作为外植体建立的离体再生体系，品种多以紫果百香果为主［7-8］，而利用百香果成熟组织为外植体建立再生体系并获得脱毒组培苗的研究鲜见报道。本研究以福建百香果3号（黄果百香果）的成熟茎段为材料，将其灭菌处理后，进行愈伤组织诱导、不定芽诱导分化成苗，经病毒检测后，挑选病毒阴性的继代苗扩大繁殖，直至长出良好的根系后驯化、移栽，以期为今后工厂化繁育无毒健壮优质的百香果种苗提供技术依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

在龙岩市农业科学研究所大棚内选取长势良好的福建百香果3号新抽10～20 cm的枝条作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的灭菌 将取回的嫩枝剪除叶片，用自来水冲洗干净，置于1%洗衣粉溶液中浸泡5 min，再用流水冲洗干净。将冲洗好的材料放入灭菌玻璃瓶中并置于超净工作台上，用75%酒精消毒10 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡10 min。在灭菌过程中需轻摇晃灭菌瓶，以保证灭菌剂全面浸泡外植体。灭菌完后再用无菌水冲洗4～5次，每次间隔3～5 min，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，备用。

1.2.2 茎段愈伤组织的诱导 试验设5个处理以MS培养基为基础培养基，添加不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L）的6-BA至MS培养基，每个处理各5瓶。将灭菌过的枝条剪成长度为0.8～1.2cm的无芽茎段，接种于培养基中，每瓶接种3个茎段（用镊子将茎段直立插入培养基中），2次重复，于接种后第30天统计愈伤组织的出愈率及生长情况，探讨不同激素组合对百香果茎段愈伤组织诱导的影响。出愈率［9］的计算公式为：

1.2.3 愈伤组织不定芽的诱导分化 将诱导出的愈伤组织切割为0.5 cm2左右的小块，接种到MS培养基，添加不同浓度6-BA、NAA、土豆泥至培养基中。分别以6-BA添加量、NAA添加量、土豆泥用量为试验因素，每个因素设定3个水平（表1），利用L9（34）正交试验，以芽诱导率为指标，确定最佳的组合。每个处理接种15瓶，2次重复。于第30天统计愈伤组织不定芽的分化率及生长情况，探讨不同处理组合对百香果愈伤组织不定芽诱导分化的影响。芽诱导率［10］的计算公式为：

表1 正交试验的因素水平

1.2.4 不定芽诱导成苗培养 将诱导分化培养所得的不定芽分成单株，接种到MS培养基，添加不同浓度和组合的NAA、IBA的不定芽诱导生根成苗培养基中，设置3个处理，每个处理接种5瓶，每瓶接种1个芽，3次重复。于第30天统计生根率及根系生长情况，探讨不同激素浓度组合对百香果不定芽诱导生根成苗的影响。生根率［11］的计算公式为：

1.2.5 病毒检测 待增殖培养的苗木数量达到较大时，挑选出生长最健壮的20瓶，分别对其进行编号，每个样品取50～100mg叶片提取总核酸，采用酶联免疫吸附法RT-PCR进行鉴定。对百香果斑驳病毒（PaMV），夜来香花叶病毒（TeMV）、东亚西番莲病毒（EAPV）、西番莲潜隐病毒（PLV）、黄瓜花叶病毒（CMV）等5种病毒分别采用各自病毒的特异引物进行检测；20 μL反转体系中，RNA加入量为1μL；PCR循环数为31个循环。

1.2.6 脱毒苗扩繁培养 对经检测已脱毒的脱毒苗株系进行扩繁培养基筛选。以MS为培养基，添加6-BA（0.5 mg/L）、不同浓度的IBA（0.1、0.2、0.3mg/L）及蔗糖（20、30 g/L）共配置6种培养基，将选取组培苗单节（带芽）茎段扦插在培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶接2个茎段，生长30 d后，调查株高、茎粗、鲜重以确定不同配比培养基对脱毒组培茎段成苗的影响。

1.3 数据分析

本试验数据采用DPS软件包建立数据库，完成正交试验设计及统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对百香果茎段愈伤组织诱导的影响

外植体接进培养基培养7 d后，茎切面的切口处开始膨大，10～12 d后在切口处开始形成浅绿色的愈伤组织点，再经过一段时间培养后，愈伤组织上形成嫩绿色的芽点，后续生长出不定芽。从30 d后的统计结果（表2）可以看出，不同浓度激素对百香果茎段愈伤组织的诱导具有较大的差异，其中处理3的出愈率最高，为83.33%，愈伤组织为绿色，颗粒状较密实，有部分芽点和不定芽分化（图1）。在低浓度时，随着6-BA浓度的升高，愈伤组织的出愈率逐渐增加，当6-BA浓度为1.5 mg/L时，愈伤组织的出愈率达到最高；随着6-BA浓度的继续增加，愈伤组织的出愈率开始下降。通过比较得出，百香果茎段愈伤组织诱导的适宜培养基为：MS培养基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖 20 g/L+琼脂 7 g/L。

表2 不同浓度激素处理对茎段愈伤组织诱导的影响

图1 愈伤组织的诱导

2.2 不同处理对百香果愈伤组织不定芽诱导分化的影响

在茎切面愈伤组织诱导分化成苗的试验过程中发现，愈伤组织的分化较愈伤组织的诱导难度更高，愈伤组织诱导分化不定芽是本研究的最难点。根据正交试验极差分析和方差分析可知，6-BA添加量、NAA添加量、土豆泥用量3种因素对芽诱导率的影响达到极显著水平（表3、表4）。影响芽诱导率高低的因素主次顺序为：6-BA添加量＞NAA添加量＞土豆泥用量。理论最优组合为A2B1C3，即以MS培养基+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+土豆泥200 g/L +蔗糖20 g/L组合的芽诱导效果最好，其不定芽诱导率为46.70%。愈伤组织诱导分化出不定芽的效果见图2。

表3 不定芽诱导的正交试验结果分析

表4 各指标方差分析结果

图2 愈伤组织诱导分化不定芽

2.3 不同激素处理组合对不定芽诱导生根成苗的影响

由表5可以看出，在培养基中添加3种不同浓度的IBA和NAA 0.2 mg/L组合，均能诱导生根，但不同处理组合对生根诱导的效果存在一定的差异。在3个处理中，以IBA 1.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L组合的诱导生根效果最好，生根率达93.33%。该组合与其他处理相比，根系较粗壮，根多且长（图3）。

表5 不同激素处理组合对不定芽诱导生根成苗的影响

图3 不定芽诱导生根成苗

2.4 病毒检测

通过RT-PCR检测技术，由龙岩市农业科学研究所提供的20份百香果组培苗样品（编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1A、1B、2A、2B、2C、3A、3B、4A、4B、4C）的病毒检测结果（图4）为：所有样品均未检测到EAPV和PLV；样品编号1、2A、2B检测到PaMV；样品编号3B检测到TeMV；样品编 号1、2、8、9、1A、1B、2A、2B、3A、3B、4B均 检测到CMV。送检的20份百香果组培苗样品有9份均不带CMV、EAPV、PLV、PaMV和TeMV等5种病毒，脱毒率为45%。

图4 福建百香果3号的病毒检测跑胶图

2.5 不同处理对百香果脱毒组培苗扩繁的影响

由表6可以看出，百香果茎节在MS培养基+6- BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L的组合中的脱毒苗生长效果较佳，表现为：株高8.03 cm，茎粗0.58 cm，鲜重0.42 g；经过40 d左右可发育成6～10 cm高的完整植株。培养一批脱毒苗的周期为40～50 d。

表6 不同激素配比对百香果组培苗扩繁的影响

3 结论与讨论

在福建百香果3号愈伤组织的诱导试验中，以MS培养基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂7 g/L的组合诱导效果最好，其诱导出愈率为83.33%；在愈伤组织诱导分化不定芽中，以MS培养基+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+土豆泥200 g/L+蔗糖20 g/L的组合诱导效果最好，其不定芽诱导率为46.70%；在不定芽诱导成苗中，MS基本培养基+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的组合诱导生根效果最好，生根率达93.33%；在脱毒苗快繁培养中，以MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L组合的效果最好，表现为生根快、茎粗壮，幼苗长势好。在上述试验中，愈伤组织诱导分化不定芽是难点，也是百香果离体培养得到脱毒组培苗的关键技术。本研究中，愈伤组织的分化较愈伤组织的诱导难度更高，愈伤组织分化不定芽的诱导率最高为46.70%，显著低于愈伤组织的出愈率（83.33%）。梁春辉等［12］在研究百香果茎段愈伤组织诱导分化的试验中，愈伤组织的最高诱导率为70.00%，愈伤组织诱导不定芽的诱导率最高为40.00%。孙琪等［10］在研究百香果组织培养技术研究中，茎段愈伤组织的最高诱导率为66.67%，愈伤组织不定芽的诱导率最高为55.56%。从研究结果可以看出，愈伤组织再分化不定芽的诱导率显著低于愈伤组织的诱导率，说明百香果愈伤组织诱导分化不定芽的相关方法还有待进一步研究，从而实现诱导分化率的提高。

在病毒检测试验发现，20份百香果组培苗样品中有9份均不含CMV、PaMV、TeMV、EAPV和PLV，脱毒率达到45%。这说明如果组培快速繁苗的速度足够快，利用百香果茎段愈伤组织为外植体建立再生体系获得脱毒组培苗这项技术完全可以满足保存优良种质资源和培育工厂化优质脱毒种苗的需求。但愈伤组织脱毒方法的缺陷是植株遗传性状存在不稳定性，可能会产生变异植株［13］，在后续研究中将重点观察评价脱毒苗的田间表现。