猪场源大肠埃希氏菌分离鉴定及耐药性分析

胡馨匀，赵官正，孙焱森，权 希，张素华，何高明，2*

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.农业农村部都市农业重点实验室，上海 200240)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)在各种环境和动物体内都广泛分布，其耐药问题已经成为一项严峻的公共卫生挑战[1]。猪大肠杆菌病可通过生物源以及环境源等途径在生猪间发生和传播。在养殖行业饲料全面禁抗之前，养殖户为防止生猪发病，长期在饮水和饲料中添加抗菌药物，加剧了大肠埃希氏菌耐药性的产生及传播。大肠埃希氏菌可通过基因突变、质粒、转座子产生耐药基因，也可以通过可移动片段获得外源耐药基因[2]。大肠埃希氏菌耐药基因的扩散与传播会导致抗菌药物作用下降甚至消失，其耐药基因可能通过食物链传播，威胁人类健康和公共卫生安全。本试验分析新疆某规模化猪场大肠埃希氏菌耐药现状，有针对性地提出猪场大肠杆菌病预防措施，为健康养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 采集新疆某规模化猪场猪呼吸道分泌物80份、肛拭子80份、环境污水样本80份，合计240份。

1.1.2 主要药品及试剂 普通LB琼脂培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝琼脂培养基，海博生物技术有限公司产品；药敏纸片，购自杭州微生物研究所；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA Marker，天根生化科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 PCR扩增仪，Techne公司产品；电泳仪，北京市六一仪器厂产品；凝胶成像仪，Biorad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离鉴定 挑取样本接种于普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基中37 ℃培养24h，经分离纯化多次得到大肠埃希氏菌纯培养物，对其进行大肠埃希氏菌生化鉴定分析。

1.2.2 细菌药物敏感性试验 采用K-B药敏纸片法进行药物敏感性试验，依据CLSI[11]所给出的敏感性范围，计算细菌对药物的敏感率和耐药率。

1.2.3 PCR引物的设计 采用文献报道引物。β-内酰胺类耐药基因选择：CTX-M[3]、OXA、TEM[4]；磺胺类：sul1、Sul2、Sul3[5]；四环素类：tetD、tetA、tetB[6]；氨基糖苷类：strA、strB、aadA[7]；喹诺酮类：qnrA、qnrB、qnrS、qepA[8]、aac(6′)-Ib[9]；酰胺醇类：floR[7]；林可胺类：ermC[10]。引物均由上海生工生物工程股份公司合成。

1.2.4 PCR扩增 反应体系为：上、下游引物各1 μL，10 μL ddH2O，7 μL Mix，1 μL DNA。反应条件为：94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次循环；72 ℃10 min终延伸，4 ℃结束反应。扩增结束后，进行电泳。根据PCR扩增结果计算分离菌株携带耐药基因检出率。

2 结果

2.1 大肠埃希氏菌的分离、鉴定

规模化猪场240份样本分离得到182株疑似大肠埃希氏菌的菌株，进行生化鉴定试验。182株分离株色氨酸肉汤反应呈阳性；MR反应为阳性，VP反应为阴性；乳糖发酵反应为阳性；西蒙氏枸橼酸盐、纤维二糖、硫化氢、氧化酶、苯丙氨酸脱氨酶反应均为阴性；赖氨酸脱羧酶肉汤反应为阳性，确定为大肠埃希氏菌。

2.2 药敏试验结果

该猪场大肠埃希氏菌对青霉素、四环素耐药，其次是林可霉素、阿莫西林、复方新诺明、链霉素和磺胺甲恶唑；对头孢噻呋钠敏感，其次是庆大霉素、卡那霉素、氟苯尼考、氨苄西林(表1)。

表1 18种常见兽用抗菌药物药敏纸片法182株大肠埃希氏菌耐药率统计表

2.3 细菌耐药基因型检测结果

耐药基因型检测结果见表2和图1。其中tetB(96.2%)、floR(95.5%)、tetA(84.1%)、aadA(80.8%)、aac(6′)-Ib(72.0%)以及strA(70.9%)耐药基因携带率较高，qnrS(68.1%)、ermC(59.0%)、sul3(57.1%)、qnrB(53.3%)、qnrA(51.6%)、qepA(49.5%)、tetD(48.9%)、strB(48.9%)、TEM(35.7%)、CTX-M(34.0%)次之，sul2(20.3%)、OXA(18.7%)和sul1(13.7%)最低。

表2 182株大肠埃希氏菌耐药基因检出率

M.DNA 标准DL 2 000;1.阴性对照；2～4.aac(6′)-Ib扩增产物

3 讨论

3.1 猪场大肠埃希氏菌耐药表型结果分析

大肠埃希氏菌总体分离率达75.8%，药敏试验结果发现，大肠埃希氏菌对头孢噻呋钠极其敏感，达100%，说明该药对该猪场大肠杆菌病的治疗仍能起到良好的效果，这与石大丽[1]的研究结果有差异，大肠埃希氏菌的耐药情况与地区流行性和用药习惯有关；对青霉素和四环素耐药菌株比例高达100%，超过50%的大肠埃希氏菌对林可霉素、阿莫西林、复方新诺明、链霉素和磺胺甲恶唑产生了耐药性，说明这几种药物对该猪场大肠杆菌病治疗效果较差。

3.2 大肠埃希氏菌耐药基因检测结果分析

β-内酰胺类3种耐药基因平均检出率为29.47%，说明该养殖场已经出现了一定程度的该耐药基因污染；头孢噻呋钠的耐药表型与基因检测结果一致性较差，表明这些基因可能存在潜在耐药性，甚至可能出现耐药基因传播现象，对防止细菌耐药有重要作用[2]。

氨基糖苷类3种耐药基因平均检出率为66.87%，表明氨基糖苷类耐药基因在养殖场内分布广泛，但与文娟等[7]的研究结果存在差异，反映出大肠埃希氏菌的耐药基因携带率存在地区差异。

四环素类耐药基因的平均携带率为76.4%，与其耐药表型试验结果一致，该结果与Boerlin P等[11]的研究结果一致，四环素类药物的长期使用，加速了tetA、tetB等耐药基因的出现和演变。

磺胺类耐药基因的平均检出率为30.37%，该试验结果其耐药表型试验结果较为符合，但与国外报道存在一定的差异[12]，原因可能是不同种属大肠埃希氏菌中的磺胺耐药基因分布情况存在显著差异。

5种喹诺酮类耐药基因的平均检出率为58.9%，该结果与石大丽[1]对猪源大肠埃希氏菌分离株的研究结果类似，原因可能是地区差异以及养殖场用药习惯的不同所导致。

本试验结果表明，该猪场大肠埃希氏菌耐药情况严重并携带多种耐药基因，应该严格规范用药，寻找替抗生物制剂，探索无抗养殖道路，才是未来养殖行业发展的趋势。