液质联用法快速检测保健食品中生物素的含量

周宏霞，张 羽，管淑霞，都 颖

（威海市食品药品检验检测研究院，山东威海 264210）

生物素即B7，属于B族维生素，又称为维生素H、辅酶R，是一种水溶性维生素，具有重要的功能。生物素是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，同时是人体内多种酶的辅酶，参与人体内脂肪和碳水化合物的代谢，对于维持机体正常生理功能有重要的作用[1-2]。其长期摄入不足会导致免疫、代谢、基因表达方面的疾病[3-4]。

目前，国标方法中尚无保健食品中生物素的测定方法。用于生物素测定的方法有微生物法[5-6]、荧光免疫层析法[7]、HPLC法[8-9]和液质联用法[2]等。其中微生物测定法灵敏度高但准确度不高；荧光免疫层析法操作比较复杂，普及性差；生物素在液相色谱紫外检测器上的响应值低，检测灵敏度不够。因此，本研究采用高灵敏性的液质联用仪对保健食品中的生物素进行检测，以建立一种快速检测方法，实现对保健食品的质量控制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-30AD高效液相色谱仪，日本岛津公司；AB6500 Qtrap三重四极杆质谱仪，美国AB公司；离心机，Eppendorf公司；涡旋混合器，德国IKA公司；电子天平（0.1 mg），赛多利斯；Milli-Q 超纯水器，美国Milipore公司。

乙腈，色谱纯，Thermo；甲酸，色谱纯，Thermo；生物素标准物质，固体粉末，纯度≥99.5%，中国食品药品检定研究所。

1.2 标准储备液配制

生物素标准储备溶液（100 μg·mL-1）：精确称取生物素10 mg，用体积分数50%甲醇溶液溶解后，用超纯水定容至100 mL，密封、避光保存。临用前根据需要用水稀释成不同质量浓度的标准溶液。

1.3 仪器工作条件

（1）色谱条件。色谱柱：Kinetex○RRC18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：乙腈；柱温：30 ℃；流速：0.30 mL·min-1；进样量：5.0 μL；液相梯度洗脱：0～2.0 min，5% B；2.0～6.0 min，5%～80%B；6.0～7.0 min，80%～90%B；7.0～8.0 min，90%B；8.1～10.0 min，5%B。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）正离子模式；扫描模式：多反应监测（MRM）模式；离子源温度：500 ℃；电喷雾电压：5 500 V；气帘气压：35 psi；雾化气压：55.0 psi；辅助气压：55.0 psi。

1.4 样品前处理

称取粉碎均匀的样品0.1 g至100 mL容量瓶中，加入10 mL的50%的甲醇水，超声20 min后，用超纯水定容至100 mL，混匀。量取10 mL于离心管中，8 000 r·min-1离心 10 min，取上清液过 0.22 μm 的滤膜上机检测。对于生物素含量高的样品，可以继续进行稀释，使其待测浓度在线性范围内。

1.5 标准工作液的配制

吸取浓度为100 μg·mL-1的生物素储备液0.1 mL至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成1 μg·mL-1的中间液。用此中间液配制成浓度为1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和 100 ng·mL-1的标准工作溶液系列。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

将生物素配制成50 μg·L-1的标准溶液，直接注入质谱仪，采用正离子扫描模式，得到准确的母离子。利用质谱仪自动优化功能，筛选二级碎片离子信息，获得碎片离子及碰撞能量，并将母离子和2个信号较强的子离子组成监测离子对，以MRM多反应监测模式进行检测。经过优化后各个质谱参数如表1所示。

表1 MRM条件下生物素的质谱参数

2.1.2 液相色谱条件的优化

本文采用甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水、乙腈-水作为流动相，发现甲醇-水、乙腈-水为流动相时响应值相对低，甲醇-0.1%甲酸水中生物素峰形比较宽，而乙腈-0.1%甲酸水中生物素响应值高，峰形好，且无杂质干扰。因此，本文采用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相，总离子流图如图1所示。

图1 生物素总离子流图

2.2 校准曲线及线性范围

用1.5配制的标准系列溶液上机检测。以质量浓度为横坐标，生物素的峰面积为纵坐标绘制校准曲线。由图2可知，校准曲线方程为Y=1.47652×105X+6 919.417 94，R=0.999 93，生物素在1～100 ng·mL-1具有良好的线性关系。

图2 生物素校准曲线

2.3 稳定性实验

样品提取后，每隔2 h测定1次样品中生物素的含量。结果发现，在2 h、4 h、6 h、8 h和10 h时生物素峰面积值稳定，RSD值为5.49%。在提取10 h内生物素含量不会发生显著变化，能够保持稳定，表明样品提取10 h内可以进行生物素准确的定量。

2.4 回收率和精密度实验

用已知浓度的样品进行3个水平的加标回收实验，每个浓度水平做6个平行，计算回收率和RSD。如表2所示，回收率在90.1%～98.1%，RSD在1.71%～3.40%。表明该方法具有良好的回收率与精密度。

表2 生物素加标回收率及精密度

3 结论

本文采用液质联用仪快速检测保健品中的生物素含量，样品加水提取后上机检测。结果表明，生物素在1～100 ng·mL-1具有良好的线性关系，校准曲线为Y=1.476 52×105X+6 919.417 94，相关系数R为0.999 93；在2～10 h生物素峰面积值稳定，RSD值为5.49%；加标回收率在90.1%～98.1%，RSD在1.71%～3.40%。该方法线性关系良好，准确度及精密度等均符合相关标准要求，适用于维生素片类保健品中生物素的测定。