纳米氧化铁的遗传毒性及其机制研究进展

赵泽浩，赵田田，王敬亭，周长慧，朱海美，常 艳

（1.上海益诺思生物技术股份有限公司，上海 201203；2.中国医药工业研究总院，上海 201201；3.复旦大学药学院，上海 201203；4.上海工程技术大学化学化工学院，上海 201620）

根据美国国家纳米技术计划的定义，纳米材料指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围（1～100 nm）或由其作为基本单元组成的材料，广泛应用于化妆品、卫生、服装、电气、农业、食品和医药等领域［1］。纳米铁是应用最为广泛的纳米材料之一。纳米铁及其氧化物材料的纳米效应使其展现出许多特殊性质，拥有较大的发展潜力和广阔的应用空间，具有重要研发价值。铁是地壳中含量最丰富的金属之一，是血红蛋白的重要组成部分，也是细胞内几种酶和电子传递系统中必不可少的元素［2］。在医药研究领域，超顺磁纳米氧化铁（superparamagnetic nano-iron oxide，SPNIO）是纳米氧化铁（nanoiron-oxide，NIO）中具有特殊超顺磁性的一类，在外部磁场作用下表现出独特的导向性，可用于磁性转染、细胞标记、磁热疗及药物载体等［3］，还可作为临床肿瘤组织造影剂和抗肿瘤药物，如已上市的欣诺（Sinerem），瑞素维特（Resovist），Supravist和Ferridex［4］。

纳米材料可通过空气、水和食物等方式进入人体，基于纳米材料的潜在危害性及广泛暴露于人群的特性，其安全性也日益受到重视。与微米级和尺寸较大的颗粒相比，纳米粒子具有更大的比表面积，并具有高化学反应活性，更有可能被人体吸收，聚集到不同器官，发生更多化学反应和生物反应，增加产生遗传毒性的风险。研究发现，纳米粒子在细胞、亚细胞和分子生物学水平（如基因和蛋白水平）等均可产生一定遗传毒性效应。广泛应用于医疗器械和造影剂领域的纳米铁药物（如SPNIO）在进入人体后可能通过长期蓄积进而诱导氧化应激等反应，引起染色体或DNA损伤［3］。

NIO是应用较为广泛的医用纳米材料之一。本文简要介绍纳米氧化铁的分类和制备方法，并以常用的纳米零价铁（Fe0）（nanoscale zero valent iron，NZVI）和SPNIO为例，介绍NIO的遗传毒性研究进展及潜在致毒机制，为纳米材料遗传毒性评价及遗传毒性机制研究提供参考。

1 纳米氧化铁的分类和制备

1.1 分类

自然环境中的铁存在于固溶态的三价铁盐或亚铁盐中，或固溶于铁氧化物中，如针铁矿和赤铁矿等。通常，人们将铁的氧化物及其羟基氧化物归属于氧化铁系列化合物，按价态、晶型和结构的不同可分为（α-，β-，γ-）Fe2O3，（α-，β-，γ-，δ-）FeOOH，Fe3O4和FeO等；按用途可分为颜料氧化铁和磁性氧化铁。较具实用价值的有α-Fe2O3，γ-Fe2O3，α-FeOOH和Fe3O4等。

NIO包括SPNIO和NZVI。其中SPNIO属于NIO中具有特殊超顺磁性的一类，与去除磁场后仍保持磁性的多畴铁磁材料不同，SPNIO会在磁场关闭的同时失去磁性。同时可在室温保持胶体的稳定性，不易发生团聚［5］，提高了其生物安全性，这些特性使SPNIO更易应用于医药领域。NZVI是一种人工合成的工程材料，内芯由零价铁组成，并非天然存在的铁的价态，而外壳由铁的氧化物构成，因此也属于NIO。Fe0的存在使NZVI表现出极强的还原性，常用于污水处理中药物降解与去除。

1.2 制备方法

纳米氧化铁的合成方法可分为3类：①物理方法，包括热解、气溶胶、电子束光刻、超声、气相沉积和微波合成等；②化学方法，包括共沉淀法、热分解法、微乳液法、化学沉积法、水热/多元醇法和微波辅助合成法等；③生物方法。使用微生物或植物提取物来合成纳米粒。该法的主要优点是节能无毒，且还原剂供应充足，经济成本较低；主要缺点是制备出的纳米粒子性质不稳定，会影响其应用。

2 常用的纳米氧化铁及其应用

NIO广泛用于生物医学领域，例如磁热疗、磁共振成像、基因传递和组织成像等［6］。NIO晶体核心可由3价铁（Fe3+）磁性材料或2价铁（Fe2+）磁性材料制成，通过化学修饰使无机、有机或聚合物等材料包被在其表面，此外还可与磁共振成像造影剂结合用于脑炎期间激活的小胶质细胞成像、干细胞示踪、装载NIO的细菌进行图像引导的贫血治疗，或进行血管成像等［7］。

近几十年，NIO在癌症治疗中取得了突破性进展，已有研究发现，铁氧体（CuFe2O4）纳米粒子暴露于人乳腺癌MCF-7细胞，氧化铁钴（CoFe2O4）纳米粒子暴露于人肝细胞（HepG2），可通过活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加细胞毒性引起细胞凋亡［8］。

2.1 超顺磁纳米氧化铁

SPNIO具有出色的磁性、电子和光学特性，已成为临床研究的重点之一。其大比表面积和疏水特性会使其更易聚集，因此具有稳定表面修饰的SPNIO才能适用于生物医学应用。SPNIO通常由直径为5～20 nm的氧化铁芯组成。氧化铁芯由磁铁矿（Fe3O4）及其氧化形式的磁赤铁矿（主要成分为Fe2O3）制成。通过使用几种类型的包覆涂层材料，如右旋糖酐、壳聚糖和聚乙二醇等修饰SPNIO表面，可增加其胶体稳定性和生物相容性，制成适合临床使用的悬浮剂［9］。SPNIO在临床上常用作造影剂，目前已上市的SPNIO造影剂（如欣诺，瑞素维特，Supravist和Ferridex等）均具有葡聚糖或羧基葡聚糖表面包覆涂层，形成的蛋白质电晕使粒子稳定性增加，生物相容性更好。此外，SPNIO还适用于体外诊断测试、体内成像、靶向药物递送和组织再生等领域。SPNIO还具有在外部磁场下产热的特性，可用于磁热疗靶向破坏肿瘤组织治疗和组织工程领域［10］。Paolini等［11］研究了由鼠李糖包覆的SPNIO，有望通过磁流体热疗的方法治疗胶质母细胞瘤。

2.2 纳米零价铁

NZVI是一种工程材料，其核心主要由Fe0组成，外壳主要由Fe0氧化形成的铁氧化物/氢氧化物构成［12］。

由于NZVI具有的壳核结构〔（Fe0)内核-铁氧化物表面〕，表现出独特的吸附性和还原性，因此在土壤和地下水有机污染物和重金属修复领域有着广泛应用。在过去十年中，NZVI越来越多地被用于净化水、土壤和沉积物，还可被用于降解药物。NZVI粒子通过Fe0核的氧化以及随后将电子分配给污染物来减少毒性物质。如NZVI可将污染物（如多氯代烃、高氯酸盐、硝酸盐、铬酸盐、亚硒酸盐、氯化物和有机染料等）还原为危害较小或稳定的化合物［13］。

3 纳米氧化铁的遗传毒性

NIO可通过产生ROS诱导各种癌细胞系的细胞毒性。Ansari等［8］通过透射电子显微镜、扫描电子显微镜和X射线衍射对NIO进行检测，结果表明，NIO可与DNA形成复合物，并插入DNA的碱基对之间；体外实验观察到大鼠淋巴细胞的细胞活力呈现NIO浓度依赖性下降，而ROS生成增加，并观察到抗酶活性的降低以及脂质过氧化作用呈现NIO浓度依赖性增加，因此推测其通过产生ROS引起体内遗传毒性。

而Kaygisiz等［14］采用不同测试系统比较了不同粒径NIO的遗传毒性。利用翅体突变与重组实验（somatic mutation and recombination tests，SMART）、葱根实验和彗星实验研究了粒径为50和100 nm NIO的遗传毒性。在SMART实验中，仅粒径为50 nm的NIO表现出明显的遗传毒性。

Sonmez等［15］通过热分解法制备了直径为20 nm的NIO，通过姐妹染色单体互换、微核和染色体畸变实验以及对8-氧-2-脱氧鸟苷的测定来评价其遗传毒性。结果表明，该粒子可引起人淋巴细胞DNA氧化损伤，产生遗传毒性，并对淋巴细胞产生细胞毒性作用，且呈浓度依赖性。

这些研究结果表明，NIO的粒径和浓度是影响其遗传毒性的关键因素，不同大小的纳米粒子可能因表观形态不同，具有不同的遗传毒性。

3.1 超顺磁纳米氧化铁

由于纳米铁表面的高催化性，包覆它们的涂层能起到屏障作用，降低毒性，且纳米铁诱导的毒性与细胞摄取量高度相关，因此需研究SPNIO能否进入细胞，甚至能否进入细胞核，从而与DNA相互作用。Pöttler等［16］采用3种不同的SPNIO：包覆月桂酸（SPNIO-lauric acid，SPNIOLA）、包覆月桂酸和白蛋白（SPNIOLA-bovine serum albumin，SPNIOLABSA）及包覆右旋糖酐（SPNIO-dextran，SPNIODEX）处理细胞，通过微波等离子体原子发射光谱分析细胞裂解液中的铁含量。结果表明，SPNIOLA能被细胞有效摄取，而SPNIOLA-BSA仅被少量摄取，SPNIO-DEX则完全不被摄取［17］。其他研究还表明，细胞对SPNIO的摄取效率取决于表面包覆的涂层和蛋白质电晕［18］。因此，推测SPNIO的表面涂层通过影响细胞摄取，进而产生不同的遗传毒性效应。摄入细胞的SPNIO越少，越难检测其遗传毒性。

SPNIO在组织与器官中的积蓄可能会产生一定毒副作用。在靶向成像和药物输送领域，SPNIO可在外部磁场作用下，被引导到特定靶区域（组织/器官），因此在同一靶区可能存在高浓度铁。大量研究证明，SPNIO浓度≥100 kg·L-1时，可引起细胞毒性，随后组织中高浓度铁离子导致稳态失衡和异常细胞反应，如氧化应激、DNA损伤和炎症反应等，从而产生遗传毒性甚至癌变［19］。

有研究以α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（αtocopheryl-polyetheleneglycol-succinate，TPGS）和十二烷基二甲基溴铵（didodecyldimethyl-ammonium-bromide，DMAB）为表面活性剂，通过乳化法制备了2种SPNIO。其中SPNIO-TPGS（180 nm）的粒径大于SPNIO-DMAB（25 nm）和裸的SPNIO（10 nm），2种制剂均带正电。在体外彗星实验中，表面有包覆的SPNIO对人淋巴细胞的遗传毒性和ROS生成量均低于裸的SPNIO，其中，SPNIODMAB遗传毒性最小［4］。表明包覆材料可能影响SPNIO遗传毒性。Hong等［20］制备了包覆正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、3-氨基丙基-三甲氧基硅烷〔（3-aminopropyl）trimethoxysilane，APTMS〕、TEOS-APTMS、柠檬酸盐SPNIO以及裸的SPNIO，粒径分别为100～150，10，100～150，10和10 nm，并检测了这几种SPNIO对成纤维细胞L-929活性与遗传物质的影响。彗星实验结果显示，裸的SPNIO及覆有TEOS的SPNIO结果为阴性；经APTMS和TEOS-APTMS包覆的SPNIO，呈现浓度依赖性遗传毒性作用，这2种SPNIO均携带正电荷，而DNA携带负电荷，表明带有正电荷的SPNIO通过核孔进入细胞核，并直接与DNA相互作用。不同表面包覆和粒径的SPNIO会引起轻微但可能有意义的细胞毒性和遗传毒性改变，这在进一步研究生物偶联和药物递送、细胞培养和肿瘤靶向应用方面具有重要价值。

3.2 纳米零价铁

NZVI广泛应用于去除污水（地面/地表）和土壤中的重金属、多环芳烃、氯化有机化合物和无机化合物［21］。NZVI在环境中具有很高的迁移能力，还能与化学污染物和生物体相互作用。关于NZVI在植物中的遗传毒性已有一定研究，Ghosh等［22］使用氯化三苯四氮唑法、偶氮蓝细胞毒性实验和彗星实验分析了NZVI对烟草花叶细胞BY-2产生的毒性作用。结果显示，NZVI在5 μg·mL-1就可产生细胞毒性与高DNA损伤。ROS的定性和定量测定证实，在低浓度NZVI作用下，细胞中积累了一定量的超氧阴离子、羟基、过氧自由基和过氧化氢［23］。因此证实了由ROS介导的NZVI细胞毒性和基因毒性，并为NZVI的安全性评价以及其他生态毒理学相关纳米材料的毒性测试提供了一定数据支持。

Ševců等［13］研究发现，NZVI可间接生成破坏铁硫基ROS，而铁硫基是许多酶中的辅助因子，导致发生芬顿（Fenton）反应，并催化产生更多ROS。生成的ROS释放到细胞质中并诱导线粒体中ROS释放，导致细胞损伤和死亡。NZVI产生ROS触发氧化应激反应的潜力受多种因素影响，如包覆涂层、流动性、粒径和测试环境中有机物或溶解盐浓度等。在评估和比较毒性反应时，可通过测量细胞对NZVI或Fe2+的吸收以及NZVI的团聚和氧化状态进行评估。

4 纳米氧化铁遗传毒性机制

4.1 氧化应激反应

ROS是一种从分子氧中衍生出来的活性分子和自由基，如羟基自由基、超氧阴离子和非自由基过氧化氢，NIO在需氧生物体内被溶解氧化，生成Fe2+和 OH-。Fe2+可通过芬顿反应（Fe2++H2O2→Fe3++OH·+OH-［24］），进一步氧化为 Fe3+，使活性较低的过氧化氢（线粒体氧化呼吸产物）转变成更强活性和高毒性的羟基自由基。高活性羟基自由基可损伤线粒体内包括脂质、蛋白质和DNA等大分子，导致基因组不稳定、细胞器失调、细胞损伤或凋亡［25］。DNA损伤包括一系列广泛性损伤，如基因组重排和基因链断裂等。过量ROS和随后发生的氧化应激反应会进一步导致染色体畸变、细胞凋亡和癌变等，产生强烈遗传毒性［26］。有研究表明，Wistar大鼠静脉给予NIO后会通过产生ROS诱导氧化应激，扰乱机体抗氧化系统［27］。Wistar大鼠口服给予NIO 1周会导致过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等抗氧化酶水平下降。其他研究也表明，NIO通过脂质过氧化、消耗谷胱甘肽和诱导氧化应激反应造成遗传物质损伤［14］。表明纳米氧化铁诱导的氧化应激反应是其遗传毒性背后的原因。

4.2 DNA损伤

对于NIO引起的DNA损伤，可能的机制有2种。①细胞暴露于具有氧化还原活性的NIO中，通过芬顿反应产生ROS，导致DNA和RNA损伤［13］。线粒体作为ROS生成场所，其DNA比核DNA对氧化损伤更敏感。ROS中最活跃的羟基自由基能攻击DNA碱基和糖基部分，从而导致糖基片段化和DNA链断裂，链断裂比碱基损伤对细胞造成的伤害更严重，对细胞更具致死性。Královec等［28］研究了由二氧化硅包覆的NIO对人肾近端小管上皮细胞（HK-2）的遗传毒性。结果表明，二氧化硅包覆的NIO 25和100 mg·L-1短期（1 h）暴露于HK-2细胞，就可引起细胞严重DNA损伤，即以DNA双链断裂形式出现致死性损伤。此外有研究报道，二氧化硅包覆的NIO对L5178Y细胞［29］、A549细胞和HeLa细胞［30］DNA的损伤作用与对HK-2细胞的作用结果相似。②NIO通过核孔进入细胞核，直接与DNA相互作用。Ansari等［8］采用荧光光谱法，用3种DNA结合型染料〔吖啶橙、烟酸己可碱（Hoechst）和 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole〕研究NIO与DNA的结合方式，评估两者的相互作用。结果表明，NIO可能通过插入DNA碱基对而直接损伤DNA。Wistar大鼠ip给予NIO后，染色体畸变率和微核诱导率呈现剂量依赖性增加，表明NIO以染色体畸变及微核形式诱导遗传毒性。

4.3 其他

某些NIO也可能导致其他形式损伤，如膜损伤、蛋白质变性、遗传毒性、免疫反应性和异物肉芽肿形成［31］。有研究报道，SPNIO还可引起细胞干扰，如肌动蛋白细胞骨架调节、基因表达谱失调、铁稳态紊乱以及细胞应答改变，如信号通路激活和细胞周期调节障碍［32］。理化性质的改变会影响物质的生物活性，NIO表面包覆材料种类繁多，这些可能产生未知的毒性机制，因此在研究NIO的毒性前需了解其化学成分、表面结构、粒径、溶解性和聚集性等性质。

5 结语与展望

纳米技术可通过多种方式改善常规药物的理化性质和生物学特性。以SPNIO为代表的生物医用纳米材料，作为临床肿瘤组织造影剂和抗肿瘤药物具有良好应用前景和重要研发价值。纳米氧化铁粒子的表面物理化学特性使其可跨越不同生物屏障，扩散到几乎每种类型细胞中，但同时也会产生一定的副作用。产生的遗传毒性效应有DNA损伤（如链断裂、加合物形成及基本位点突变）、染色体异常（如染色体数目或结构的改变）和微核的形成。但NIO等纳米材料的致毒机制尚未明确［33-34］。有研究支持的毒性机制之一是产生ROS，引起氧化应激，从而通过调节细胞内钙浓度、激活转录因子和诱导细胞因子产生而触发炎症反应［35-36］。炎症和氧化应激破坏包括脂质、蛋白质以及DNA在内的生物分子，进而造成细胞和组织损伤，最终导致与疾病相关的遗传毒性、细胞毒性和纤维化反应［37］。造成纳米铁材料毒性作用机制尚未明确的可能原因是未建立高效且标准化的纳米粒子毒性筛选方法［38］。目前对于纳米氧化铁的毒性评价较少，因此迫切需要开发纳米氧化铁相关安全性和生物相容性评价方法，尤其是遗传毒性研究评价方法。遗传毒性实验的关键是需要涵盖所有必要的终点：基因突变、染色体畸变（断裂性）和染色体数量的变化（非整倍体）。由于纳米粒子具有与尺寸相关的特殊物化性质，许多标准的测试方法不适用于其毒性测试，或需要对测试方案进行优化。如用于评估基因突变的细菌回复突变实验由于细菌体积较小（与纳米粒子相当），以及细菌细胞壁与人类/哺乳动物细胞膜不同，并不适合于纳米粒子遗传毒性的评价［39-41］。因此，在检测策略中，建议将哺乳动物基因突变检测与微核实验结合起来［42］。此外，还有许多其他检测方法针对中间终点，如各种类型的DNA损伤和新的标记物，可以检测遗传组学或表观遗传学的变化。这些标记物可在一定程度上反映包括纳米粒子在内的被测试化合物的安全性［43-44］。遗传毒性评价应采用一体化、多端点实验方法，如使纳米粒子暴露于3D模型，然后用多个荧光探针进行单细胞分析，以确定纳米粒分布、ROS诱导、染色体断裂/丢失的特定染色体序列以及表观遗传变化（低甲基化）的标记［45］。同时监管机构应制定严格的指导方针。在成功改善药物安全性、功效和质量后，纳米铁材料的进一步开发和应用会为多种疾病的治疗提供新的手段。