姜黄素对脐带间充质干细胞脂毒性损伤及生物功能的影响

罗瑞熙， 赵立凤， 李帅帅

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞，具有免疫调节、组织损伤修复的功能[1]，有一定的临床应用前景[2]。课题组前期研究显示，MSCs可以减轻高脂饲料诱导的大鼠脂代谢紊乱及早期主动脉内膜增厚现象；还可以通过抑制内质网应激途径减轻人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)脂毒性损伤[3]。当MSCs长期处于高脂、高糖、炎性、缺氧等微环境下，会损伤细胞存活率和功能，进而降低MSCs的治疗效果[4]。

目前，中药复方及单体成分对MSCs功能的改善逐步成为研究热点[5]。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、郁金、莪术的干燥根茎中提取的一种天然有效成分[6]，具有抗炎、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗凝、抗肝纤维化等药理活性，而且毒性低，不良反应小[7]。研究表明，姜黄素可通过调节Akt/ERK通路改善线粒体功能来减轻H2O2诱导的大鼠MSCs氧化应激损伤[8]；通过调节TERT通路促进大鼠MSCs增殖，延缓MSCs衰老[9]，但是否可通过抑制内质网应激途径减轻高脂环境下MSCs脂毒性损伤尚不明确。因此，本研究拟建立棕榈酸诱导的MSCs脂毒性损伤模型，以内质网应激为切入点，探讨姜黄素对MSCs脂毒性损伤的调节作用，同时观察其干预是否有助于提高MSCs对HUVECs的保护作用，为相关临床应用提供实验基础。

1 材料

1.1 细胞 人脐带间充质干细胞(MSCs)和人原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自美国ScienCell公司。

1.2 试剂与药物 姜黄素(美国Selleck公司，货号S1848，纯度99.83%)。DMEM低糖培养基、胎牛血清(美国Gibco公司，批号12320032、10091148)；ECM内皮细胞培养基(美国ScienCell公司，货号1001)；棕榈酸[爱必信(上海)生物科技有限公司，货号abs47001260]；AccutaseTM细胞消化液(美国eBioscience公司，批号00-4555-56)；CCK-8细胞活性检测试剂盒(日本同仁化学研究所，货号CK04)；油红O染色试剂盒、4%组织细胞固定液、牛血清白蛋白BSA、RIPA细胞高效裂解液、10×TBST缓冲液(北京索莱宝科技有限公司，货号G1262、P1110、A8850、R0010、T1081)；甘油三酯(TG)检测试剂盒(美国Abnova公司，货号K622-100)；TRIzolTMReagent(美国Ambion公司，批号15596026)；5×qRT SuperMix、2×SYBR Green qPCR Master Mix、C/EBP 同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)抗体(美国Bimake公司，货号JW20、B21202、A5462)；BCA蛋白定量试剂盒、10% PAGE凝胶快速制备试剂盒、蛋白酶抑制剂混合液、蛋白上样缓冲液、三色预染蛋白Marker、0.22 μm PVDF膜、快速转膜缓冲液(上海雅酶生物科技有限公司，货号ZJ102、PG112、GRF101、LT103、WJ103、WJ001、PS101S)；脱脂奶粉(北京博奥拓达科技有限公司，批号232100)；免疫球蛋白重链结合蛋白(binding immunoglobulin protein，BiP)抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，货号11587-1-AP)；β-actin抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号AC026)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZB-2301)；超敏ECL化学发光试剂盒(美国Thermo公司，货号32209)。甲醇、异丙醇、无水乙醇均为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

1.3 仪器 CO2细胞培养箱(美国Sanvall公司)；超净工作台(美国Nuaire公司)；全自动多功能酶标仪、荧光分光光度计(美国Thermo公司)；低温离心机(德国Beckman公司)；Transwell共培养小室、超纯水系统(美国Milipore公司)；高压灭菌锅(德国Systec公司)；倒置相差显微镜(德国Leica公司)；PCR扩增仪、荧光定量PCR仪、蛋白凝胶电泳仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；超低温冰箱(日本三洋公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 MSCs用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM低糖培养基培养，HUVECs用ECM内皮专用培养基培养，均置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。待细胞生长至80%融合度时进行传代，取对数生长期者用于实验。在共培养实验下，MSCs种于Traswell小室上层，HUVECs种于6孔板培养皿底部，两者初始细胞比例为1∶5，共培养培养基采用ECM，除部分RT-qPCR相关实验外，共培养时间为24 h。

2.2 分组及给药 MSCs细胞分为4组，分别为正常组、姜黄素组、棕榈酸(200 μmol/L)组、棕榈酸(200 μmol/L)+姜黄素(5 μmol/L)组，加药干预以探究黄素干预对MSCs脂毒性损伤及生物功能的影响；HUVECs细胞分为4组，分别为正常组、棕榈酸(50 μmol/L)组、棕榈酸(50 μmol/L)+MSCs(200 μmol/L棕榈酸预处理24 h)组、棕榈酸(50 μmol/L)+MSCs(200 μmol/L棕榈酸+5 μmol/L姜黄素预处理24 h)组，MSCs与HUVECs共培养以探究姜黄素预处理对MSCs提高HUVECs活性的影响。

2.3 细胞活性检测 细胞以每孔8 000个的密度接种于96孔板，按“2.1”“2.2”项下方法分组、培养和给药，培养24 h后吸弃培养基，PBS清洗1次，加入100 μL CCK8工作液，在37 ℃下孵育2～6 h后, 采用酶标仪在450 nm波长处检测光密度(OD)值，计算细胞相对活性。

2.4 油红O染色 细胞接种于6孔板，按“2.1”“2.2”项下方法分组、培养、给药，培养24 h后吸弃培养基，PBS清洗1次，10%中性甲醛固定10 min，吸弃中性甲醛固定液，PBS清洗3次，取油红O工作液1 mL加入6孔板中，室温染色30 min，吸弃染液，60%异丙醇漂洗后PBS清洗3次，苏木素复染后PBS清洗3次，在倒置显微镜下观察并拍照采集图像。

2.5 细胞TG水平检测 细胞接种于6孔板，按“2.1”“2.2”项下方法分组、培养、给药，培养24 h后将各组细胞数矫正为一致，每孔加入100 μL脂质提取缓冲液，盖上孔板盖并用封口膜密封，置于90～100 ℃烘箱中孵育30 min，当液体呈现浑浊时将孔板取出，并降温至室温，振荡1 min混匀液体，吸取50 μL加到96孔板上，每孔加入2 μL脂肪酶溶液，室温静置10 min，按照每孔2 μL探针、2 μL酶混合液、46 μL稀释缓冲液的比例配制反应液，并加入相应孔中，室温避光孵育30 min，采用酶标仪在570 nm波长处检测OD值，根据标准曲线计算各组细胞TG水平。

2.6 RT-qPCR法检测BiP、CHOP、XBP1 mRNA表达 细胞接种于6孔板，按“2.1”“2.2”项下方法分组、培养、给药，培养12 h后收集细胞，TRIzol法提取总RNA并逆转录为cDNA，采用Bio-Rad荧光定量PCR仪进行RT-qPCR反应，反应条件为预变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共39个循环；熔解曲线反应条件为65～95 ℃ 10 s (每0.5 ℃梯度检测)。结果采用2-ΔΔCT相对定量法分析。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot法检测BiP、CHOP蛋白表达 细胞接种于6孔板，按“2.1”“2.2”项下方法分组、培养、给药，收集细胞，加入含1% PMSF的RIPA细胞裂解液裂解细胞，BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白浓度后在-80 ℃下保存备用。蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗(1∶5 000)，37 ℃摇床上孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，ECL显影发光液轻微冲洗，置于凝胶成像仪中进行曝光，采用Image J pro软件进行灰度分析，以β-actin为内参，计算蛋白相对表达。

3 结果

3.1 姜黄素减轻棕榈酸诱导的MSCs活性损伤 姜黄素在5 μmol/L浓度以下对MSCs无毒性作用，见表2。棕榈酸刺激MSCs 24 h后，对细胞的毒性作用呈剂量依赖性，见表3，故选取200 μmol/L棕榈酸刺激24 h建立MSCs脂毒性损伤模型。如表4所示，棕榈酸刺激后MSCs细胞活性降低约22%，而5 μmol/L姜黄素干预后细胞活性恢复至94%，提示姜黄素可改善棕榈酸对MSCs细胞活性的抑制作用。

表2 姜黄素对MSCs细胞活性的影响

表3 棕榈酸对MSCs细胞活性的影响

表4 姜黄素对棕榈酸诱导的MSCs损伤细胞活性的影响

3.2 姜黄素减轻棕榈酸诱导的MSCs脂质沉积 脂质沉积是棕榈酸诱导MSCs脂毒性损伤的主要表现之一。如表5、图1所示，正常组和姜黄素组均无明显脂滴沉积；棕榈酸刺激24 h能诱导MSCs脂质沉积增加，升高TG水平(P<0.05)；姜黄素干预后能减少细胞脂质沉积，降低TG水平(P<0.05)，提示姜黄素可减少棕榈酸诱导的MSCs胞内脂质沉积。

表5 姜黄素对棕榈酸诱导的MSCs细胞TG水平的影响

图1 各组细胞脂质沉积(×200)

3.3 姜黄素减轻棕榈酸诱导的MSCs内质网应激 如表6所示，棕榈酸刺激MSCs 12 h后，内质网应激相关基因BiP、CHOP、XBP1 mRNA表达均升高(P<0.05)，而5 μmol/L姜黄素干预后BiP、CHOP、XBP1 mRNA表达降低(P<0.05)。如图2、表7所示，与正常组比较，棕榈酸组内质网应激早期标志蛋白BiP和晚期标志蛋白CHOP表达均升高(P<0.05)；与棕榈酸组比较，姜黄素干预后BiP、CHOP蛋白表达降低(P<0.05)。如图3、表8所示，姜黄素单用对BiP、CHOP蛋白表达无明显影响(P>0.05)。以上结果提示，姜黄素可减轻棕榈酸诱导的MSCs 内质网应激。

表6 姜黄素对棕榈酸诱导的MSCs细胞BiP、CHOP、XBP1 mRNA表达的影响

图2 各组细胞BiP、CHOP的蛋白表达

图3 姜黄素干预后MSCs细胞BiP、CHOP蛋白表达

3.4 姜黄素预处理提高MSCs对HUVECs脂毒性损伤的保护作用 如表9所示，与正常组比较，棕榈酸诱导HUVECs 24 h后细胞活性降低约50%；与棕榈酸组比较，MSCs(棕榈酸预处理)组HUVECs活性提高至67%左右，而MSCs(棕榈酸+姜黄素预处理)组HUVECs活性进一步提高至89%左右，提示姜黄素对MSCs的脂毒性损伤保护作用有助于提高其对HUVECs脂毒性损伤的保护。

表7 姜黄素对棕榈酸诱导的MSCs细胞BiP、CHOP蛋白表达的影响

表8 姜黄素对MSCs细胞BiP、CHOP蛋白表达的影响

4 讨论

近年来，许多研究报道中药可通过改善MSCs细胞活性及功能从而提高MSCs治疗效果[10-11]。中药对MSCs损伤的保护作用已被广泛报道[12]，其中姜黄素因其抗炎、抗氧化、调脂等特性成为了近期研究热点之一。姜黄素可通过减轻MSCs衰老从而提高MSCs生物活性[9]；Ruzicka等[13]报道了姜黄素和MSCs对脊髓炎症损伤具有协同干预作用；Attari 等[14]研究表明姜黄素可以提高MSCs活性，然而对神经干细胞活性并无影响作用。因此，本研究探索了姜黄素是否对棕榈酸诱导的MSCs细胞活性损伤具有保护作用，结果提示姜黄素可提高MSCs细胞活性。然而，在过量的游离脂肪酸刺激MSCs引起的脂毒性损伤过程中，其损伤机制与炎性损伤明显不同，因此本研究进一步对姜黄素是通过何种途径干预MSCs脂毒性损伤进行了探索。

表9 姜黄素预处理MSCs细胞对其干预棕榈酸诱导的HUVECs细胞活性的影响

脂毒性损伤一般指异常的脂质累积而诱发的细胞损伤。目前认为，饱和脂肪酸诱发细胞脂毒性损伤的主要机制包括内质网应激途径、ROS途径、溶酶体途径、c-JUN激酶途径、过量神经酰胺生成等[15]，其中内质网应激诱导的细胞损伤是最近研究被认为最重要的途径之一。BiP是主要的内质网分子伴侣，协助蛋白质折叠及装配，降解错误折叠的蛋白，维持内质网的稳态和控制内质网应激传感器的激活，是细胞维持正常功能的重要调节蛋白。当内质网腔内未折叠蛋白增加时，BiP变为游离状态，早期BiP的解离有助于恢复蛋白质的正确构象，是内质网应激早期的标志蛋白之一[16]。CHOP是内质网应激特异的促凋亡因子，通过基因转录调控启动下游凋亡通路。本实验结果发现，单用姜黄素浓度在5 μmol/L以下时并未对BiP和CHOP蛋白表达有明显的影响；而棕榈酸能升高二者的表达，提示内质网应激发生；姜黄素干预能抑制棕榈酸引起的BiP和CHOP表达升高，提示姜黄素对棕榈酸引起的MSCs内质网应激有抑制作用。因此推测姜黄素对MSCs脂毒性损伤的改善可能是通过抑制内质网应激途径实现的。

为了探究姜黄素对MSCs脂毒性损伤的改善是否有助于提高其干预效果，建立了体外HUVECs脂毒性损伤模型，并通过Traswell小室共培养系统将经过棕榈酸或棕榈酸+姜黄素预处理24 h后的MSCs与HUVECs进行共培养。结果发现，经过棕榈酸+姜黄素预处理的MSCs相对于棕榈酸单独预处理的MSCs能更好地提高HUVECs细胞活性(分别为67%、89%)，提示姜黄素对MSCs脂毒性损伤的改善有助于提高其干预效果。Liu等[17]研究显示姜黄素预处理脂肪来源的MSCs有助于提高其抗凋亡和促血管生成能力，从而提高MSCs的心肌修复能力。Wang等[18]发现姜黄素预处理MSCs可以提高其促小鼠皮肤伤口愈合能力，而此种促进作用与PGC-1α/SIRT3通路有关。因此推测姜黄素预处理MSCs可提高其对多种疾病模型的干预效果，其分子机制有待进一步研究。

综上所述，姜黄素可以恢复棕榈酸引起的MSCs细胞活性下降，减轻脂质沉积，缓解内质网应激，从而减轻MSCs脂毒性损伤；同时，此保护作用可提高MSCs对HUVECs脂毒性损伤的干预效果。