肿瘤细胞来源的外泌体在肿瘤微环境中的调控作用及其与肿瘤相关巨噬细胞的关系

裴文浩，王文锐，杨清玲，陈昌杰*

（1.蚌埠医学院癌症转化医学安徽省重点实验室，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室）

肿瘤的恶性表型是由癌细胞及其周围的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）共同决定的［1］。除肿瘤细胞外，TME还含有多种基质细胞，包括成纤维细胞、淋巴细胞、炎症细胞、内皮细胞和间充质干细胞［2］。这些细胞总是与肿瘤细胞一起进化。TME中的细胞通讯对肿瘤的发生发展以及侵袭、转移等恶行生物学行为有重要影响［3］。然而，肿瘤细胞通讯的分子机制尚未完全阐明。

先前的研究主要集中在肿瘤细胞和免疫细胞之间通过直接接触和分泌信号分子，如可溶性细胞因子和趋化因子的异型相互作用［4］。外泌体的发现为肿瘤免疫的深入研究提供了新的视野。与对照组的癌旁组织或正常组织相比，肿瘤相关巨噬 细 胞 （tumor-associated macrophages，TAMs）在大多数人类肿瘤组织中都表现出更强的浸润性［5］，这说明TAMs在肿瘤的发生发展中起到重要的作用。研究表明，TAMs与多种细胞类型相互作用，重新编程并诱导巨噬细胞极化［6］。TAMs失去杀伤能力，随后获得一种抑制表型，从而促进肿瘤的发展，肿瘤细胞来源的外泌体在这一过程中通常起着重要作用。同时TAMs会释放促进肿瘤发展的外泌体。本文将综述外泌体在肿瘤细胞与TAMs通讯中起到的作用，以及外泌体在靶向治疗中潜在的作用。

1 TME

TME是一个由恶性肿瘤细胞、肿瘤浸润免疫细胞、内皮细胞、胶质细胞、肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）以及这些细胞分泌的细胞因子和趋化因子组成的独特体系［7］。非肿瘤细胞主要包括血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、固有免疫细胞（TAMs、DCs、NK细胞等）、获得性免疫细胞（T和B淋巴细胞）和各种间质细胞［8］。TME中各种细胞相互作用且彼此影响，其代谢产物不仅是能量供应的来源，同时也介导了TME中各种细胞之间的信息传递。一方面，恶性肿瘤细胞可利用其代谢产物改变肿瘤浸润性免疫细胞的代谢模式，诱导其发挥免疫抑制功能，并进一步从外周招募免疫抑制性细胞进入肿瘤组织。例如，恶性肿瘤细胞通过糖酵解生成乳酸，导致TME酸化，从而抑制免疫系统的肿瘤识别能力和抗肿瘤反应［9］。另一方面，肿瘤浸润免疫细胞的代谢产物也可促进肿瘤发展。例如，TAMs可分泌肾上腺髓质素（ADM）促进肿瘤新生血管生成，从而促进黑色素瘤的生长［10］。综上所述，TME中的恶性肿瘤细胞和免疫细胞之间相互作用，协同促进肿瘤的发展。

2 外泌体

外泌体是直径在30～150 nm的细胞外小泡，具有核内体来源，根据细胞来源不同，外泌体含有多种细胞成分，包括DNA（线粒体和基因组）、脂质（膜）、蛋白质、转座子和RNA（编码RNA及非编码RNA）［11］。当内体成熟时，这些物质转化为多囊泡体（MVB），并运输到质膜，然后以外体的形式释放出细胞。目前，已有研究证实MVB的分选机制有助于用特定的蛋白质和RNA分子选择性地富集外泌体。这些机制表明，分子分选到外泌体是一个受调控的过程，而不是像病理过程一样［12］。

蛋白质外泌体的分选有翻译后修饰的参与，如泛素化负责分离主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC-Ⅱ）［13］和致癌蛋白表皮生长因子受体（EGFR）［14］。此外，RNA诱导沉默复合体（RISC）蛋白，包括AGO2、GW182［15］和包含有 GAGG 序列的 RNA结合蛋白（RBPs）［16］已被证实是分离特定RNA到外泌体中的必须物质。外泌体通过受体介导的内吞、胞饮、吞噬作用或者是与细胞膜的融合被受体细胞内化，导致其内容物直接释放到细胞质中，外泌体传递分子信号可以改变受体细胞的功能和表型。外泌体中特定的细胞成分靶向积累表明他们在调节细胞通讯方面起着至关重要的作用［17］。

外泌体通过调节TME参与肿瘤的发生和发展。在肿瘤细胞和TAMs之间同样也存在着外泌体介导的细胞与细胞间的通讯，它可以调节肿瘤细胞的生物学特性，从而影响TAMs的极化，进而促进或阻碍肿瘤的发展［18］。外泌体的功能主要取决于其来源和含量［19］。另外，还有研究表明外泌体诱导的细胞通讯是专门用于远距离相互作用的［20］，促进蛋白和后续在靶细胞中表达的功能性mRNA和miRNAs的转移［21］。因此，深入了解外泌体调控TAMs和肿瘤细胞之间通讯的分子机制，可能会有助于开发新的逆转肿瘤抑制免疫反应的抗肿瘤治疗方案。

3 TAMs

3.1 TAMs的形成 TAMs是肿瘤微环境细胞的一个亚群，来源于骨髓中的单核细胞，在实体瘤中影响肿瘤的进展［22］。Cortez-Retamozo 等［23］研究发现，脾脏中的CD11b（+）Ly-6C（hi）单核细胞是TAMs的另一个来源。研究表明，肿瘤源性趋化因 子 配 体 （CCL2、 CCL3、 CCL4、 CCL5、CCL7、CCL8、CXCL12）、血小板衍生生长因子（PDGF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、血管内皮生长因子（VEGF）和白介素10（IL-10）等使单核细胞在TME中聚集，分化成的TAMs通过产生细胞因子、生长因子、趋化因子和细胞外小泡等参与肿瘤的发展［24］。

3.2 TAMs表型及功能特性 TME中的巨噬细胞即为TAMs，因所处环境的差异而有不同的分化，具有高度的可塑性［15］。Laviron 等［25］认为 TAMs至少被活化成两个亚型，即M1型（传统激活）和M2型（替代激活），它们在肿瘤中发挥的作用几乎相反（抗肿瘤/促进炎症和促肿瘤/抑炎症）。

3.2.1 M1型TAMs 在宿主体内，经典激活的M1型巨噬细胞通常会受到感染或组织损伤的刺激，并且还可以通过细菌配体（如脂多糖）或细胞因子（如干扰素γ）在体外被激活，M1型巨噬细胞具有促炎特性，并且分泌细胞因子，如白介素1（IL-1）、IL-6、IL-12和肿瘤坏死因子α（TNF-α）［25］。此外，这些细胞会分泌一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）［26］。M1型巨噬细胞分泌的细胞因子除了能防御病原体入侵还能够刺激其他免疫细胞，如辅助T细胞1和17（Th1、Th17）以及自然杀伤细胞（NK）［27］。典型激活的M1巨噬细胞产生的ROS与氮物种和促炎细胞因子的能力是防御病原体和抗肿瘤的关键，这让M1巨噬细胞成为“好巨噬细胞”［28］。

3.2.2 M2型TAMs 巨噬细胞被一系列刺激因子（IL-4、IL-10、IL-13）以及Toll样受体和IL-1受体的配体交替激活，导致表型分化为抗炎M2巨噬细胞［27］。这些细胞通过产生IL-10、CCL18、CCL22和降低IL-12的分泌发挥其抗炎作用［29］。由于他们在肿瘤进展和侵袭中的作用，他们被认为是“坏巨噬细胞”［30］。

4 肿瘤来源的外泌体调节巨噬细胞极化

肿瘤来源的外泌体在免疫调节中也起着至关重要的作用。研究表明，外泌体可以重塑肿瘤免疫微环境，有利于肿瘤的促进状态，支持肿瘤的发生、侵袭、血管生成、转移前的生态位形成和转移扩散［31］。基于不同的分子组成，外泌体可以将巨噬细胞转换为M1或M2表型［32］。

4.1 miRNAs miRNAs是一种小的、非编码RNA，长度通常为20～25个核苷酸，通过与特定的mRNA序列结合，抑制靶基因的翻译［33］。肿瘤来源外泌体最显著的特征之一是由多个miRNAs组成，成熟的miRNAs占所有RNA的41.7%［34］。多个miRNAs被认为是外泌体的关键生物活性成分。外泌体miRNAs可通过影响巨噬细胞表型、细胞因子分泌、T细胞相关免疫耗竭和缺氧微环境来调节TAMs功能。

越来越多的证据表明，外泌体miRNAs通过调节靶分子在TAMs的浸润和极化过程中发挥重要的生理功能。Zhao等［35］在结直肠癌（CRC）肝转移组织中发现，miR-934在CD163+TAM浸润丰富的区域表达升高；此外，外泌体miR-934通过下调PTEN表达和激活PI3K/AKT信号通路而诱导M2巨噬细胞极化。许多重要的转录因子，如PPAR、STAT3和STAT6参与了TME中巨噬细胞的极化。Ying等［36］研究表明，上皮性卵巢癌（EOC）来源的外泌体miR-222-3p诱导了TAM样巨噬细胞表型，并通过SOCS3/STAT3途径极化为M2表型。此外，当CXCL12/CXCR4轴激活时，CRC细胞来源的外泌体miRNAs，miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p，通过抑制共同的靶基因PTEN和激活PI3K/AKT通路而诱导M2极化的巨噬细胞表型［37］。

外泌体影响巨噬细胞极化，并影响巨噬细胞与其他免疫细胞，特别是参与调节肿瘤免疫微环境的T细胞之间的相互作用。内质网应激诱导肝癌细胞释放外泌体miR-23a-3p，通过激活Stat3信号通路上调巨噬细胞PD-L1的表达，减弱抗肝癌免疫反应［38］。来自癌细胞的外泌体miR-21和miR-29a触发人和小鼠TLR8介导的核因子-κB（NF-κB）在巨噬细胞中产生IL-6和IL-6［39］。在TME中，低氧肿瘤细胞与免疫细胞广泛沟通，为癌细胞免疫逃逸创造有利条件。有研究表明，缺氧促进外泌体分泌，导致癌细胞的侵袭性表型和血管生成［40］。大量研究表明，缺氧诱导的肿瘤外泌体含有各种非编码RNA，特别是参与肿瘤进展的miRNAs。这些外泌体还促进M2巨噬细胞极化和miRNAs介导的巨噬细胞代谢转变。Chen等［41］证明了卵巢上皮癌低氧环境中的外泌体富含miR-21-3p、miR-125b-5p、miR-181-3p，这些miRNAs被原始巨噬细胞内吞，并通过激活SOCS4/5/STAT3/HIF1通路促进TAMs极化。缺氧通过激活许多转录因子，如Snail和Twist，为上皮-间充质转化（EMT）的进展创造了一个不可或缺的环境［42］。在Snail过表达的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞中，Snail可以通过直接结合的方式增强miR-21的表达，之后包装在外泌体中，在被巨噬细胞吞噬后，外泌体miR-21下调PDCD4和IL-12a的表达并介导M2极化［43］。综上所述，肿瘤细胞来源的外泌体miRNAs对TME中的TAM极化有关键影响。这些miRNAs可以用作肿瘤生物标记物来监测肿瘤进展，也可以用作重要的药物设计靶点或药物载体［44］。

4.2 LncRNAs LncRNAs为长度超过200个核苷酸，但不编码蛋白质的RNA。据报道，LncRNA TUC339在肝癌来源的外泌体中高表达，其可以在肝癌细胞间相互转移，促进肿瘤生长和转移，此外，外泌体LncRNA TUC339可转移到邻近巨噬细胞，诱导巨噬细胞极化为M2表型，从而抑制抗肿瘤免疫应答［45］。来源于乳腺癌细胞的外泌体lncRNA BCRT1被巨噬细胞内化以促进M2极化，增强癌细胞的迁移和趋化能力，加速乳腺癌的进展［46］。

许多位于细胞质中的LncRNAs作为竞争的内源性RNA（CeRNA）海绵来调节miRNAs的表达和生物学功能，并参与肿瘤的进展。细胞质中的LncRNAs可以被分选为外泌体并被TAMs吸收，但它们是否通过海绵吸附来调节TAMs极化还有待进一步研究。此外，在癌细胞衍生的外泌体中也发现了其他非编码RNA，如环状RNA（CircRNAs）［47］。这些外泌体CircRNAs可以影响TME中的细胞通讯。肝癌来源的胞外体CircUHRF1通过靶向miR-449c-5p/Tim-3诱导NK细胞耗竭，从而导致对抗PD-L1治疗的抵抗［48］。外泌体CircRNAs是否影响巨噬细胞极化还有待研究。

4.3 蛋白质 除了RNA，质膜蛋白还通过胞外结构域脱落和微囊释放选择性地进入细胞外空间。与以质膜出芽方式所释放的囊泡不同，外泌体通过内吞途径在多囊体中产生，然后当这些胞体与质膜融合时被移除［49］。Peinado等［50］已经确定了黑色素瘤细胞通过外泌体运输的一种癌蛋白，即受体酪氨酸激酶MET，它会引发长距离炎症，从化学反应上吸引循环中的癌细胞。包装成外泌体的肿瘤相关蛋白可以在外泌体中被受体细胞摄取后保持其活性，有研究表明，肿瘤来源的外泌体蛋白改变了单核细胞来源的巨噬细胞的表型，Liang等［51］发现核糖核酸酶PRNA组分H1（RPPH1）与β-IIItubulin（TUBB3）结合，以阻止其泛素化，然后诱导子宫内膜样变促进转移，此外，RPPH1通过外泌体转移到巨噬细胞，介导巨噬细胞M2极化。经大肠癌细胞来源的外泌体处理后，单核细胞来源的巨噬细胞表现为CD206 high/HLA-DR low表型，M2细胞形态伸展和拉长。同样，Ham等［52］发现IL-6受体gp130存在于乳腺癌细胞来源的外泌体中，可刺激骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）中的IL6/STAT3信号激活，磷酸化的STAT3转位到细胞核，诱导靶基因的转录，包括巨噬细胞极化相关基因、IL-6、IL-10、CXCR4和CCL2，这种激活促进了BMDM的存活，并诱导BMDM向促癌表型转变。与外泌体RNA的研究相比，巨噬细胞和TME中外泌体蛋白的功能和机制还需要进一步的研究来阐明。

4.4 脂质 在外泌体中已经发现了一些融合膜脂，它们在外泌体与质膜的融合中起着至关重要的作用。花生四烯酸（AA）是产生促炎脂质介质的主要多不饱和脂肪酸前体，其通过将紧密结合的脂质双层转化为六角形结构来促进膜联蛋白2介导的膜融合，从而破坏膜的稳定性［53］。胰腺癌细胞ASPC-1来源的外泌体比受体细胞含有更高的AA水平，有利于其与THP-1来源的巨噬细胞融合，AA可增加前PGE2的分泌，增加M2表型的表达水平，并增强促进肿瘤进展的血管内皮生长因子、MCP-1、IL-6、IL-1β、MMP-9和TNF-α等生物活性分子的分泌［54］。

现有的研究集中在外泌体对巨噬细胞极化进入M1或M2型状态的影响。然而，这种二分法远远不足以解释TAMs的复杂性，因为极化在TME中是一个动态和可逆的过程，因此，需要进一步的研究来理解外泌体如何决定巨噬细胞向不同表型极化。有必要建立模型系统来研究不同亚型的巨噬细胞，寻找更准确的分子标志物来表征TAMs。同样需要指出的是，内吞作用被认为是外泌体将其内容物运送到TAMs的主要机制。这一过程是否在TAMs的极化过程中起作用，是否与内吞作用不同，值得进一步研究。

5 巨噬细胞衍生外泌体与肿瘤进展

大多数TAMs缺乏吞噬肿瘤细胞的能力，而促进肿瘤细胞逃逸，使其能够转移到远处组织。TAMs和癌细胞之间相互的外泌体交换也调节癌症的进展。

5.1 调控肿瘤的增殖、迁移和侵袭 越来越多的证据表明，TAMs衍生的外泌体在促进癌症发生和发展中起着重要作用。Zheng等［55］的研究发现，M2巨噬细胞衍生外泌体中的一种特殊蛋白ApoE介导了受体GC细胞中ApoE激活的PI3K/AKT通路的细胞间转移，并增强了转移潜能。这些结果突显了巨噬细胞外泌体在肿瘤进展过程中TAMs与肿瘤细胞之间的相互作用中的重要性。

5.2 促进血管生成 肿瘤的生长和转移在很大程度上依赖于血管生成。有研究表明，肿瘤组织中TAMs浸润的数量与肿瘤血管密度密切相关［56］。在缺氧区，特别是在坏死组织中发现了大量的TAMs聚集体，TAMs可以释放促进肿瘤发展的细胞因子，如IL-1β、血管内皮生长因子、TNF-α等细胞因子，El-Arabey等［57］的研究发现，转录因子GATA3从TAMs来源的外泌体中大量释放，在TAMs与突变型TP53表达的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）之间的相互作用中发挥关键作用，通过表观遗传调控促进血管生成和子宫内膜异位症。同样，M2巨噬细胞来源的外泌体miR-501-3p通过增加胰腺导管癌细胞血管生成相关蛋白VEGF-1-3p的表达而增强其管状形成能力［58］。

5.3 产生抗药性 药物治疗是控制肿瘤进展的主要治疗策略。然而，耐药性是实施此类疗法的一个重大障碍。有研究表明，肿瘤细胞和间质细胞都可以分泌含有耐药相关因子的外泌体，并将它们转移到TME进行相互作用，从而增加耐药性［59］。

5.4 对肿瘤新陈代谢进行重新编程 代谢重编程是恶性肿瘤的一个标志，Warburg等［60］发现，即使在氧气充足的情况下，癌细胞的糖酵解速率也远远高于氧化磷酸化（OXPHOS），这就是所谓的沃伯格效应（Warburg Effect）。此后，一系列研究表明，除葡萄糖外，参与葡萄糖、氨基酸和脂类代谢途径的异常代谢物也可诱导肿瘤相关代谢重编程，从而催生了免疫代谢研究领域［61］。这些分子代谢物通过胞外途径转移到TME中，影响受体细胞的新陈代谢，有利于肿瘤的进展。Wang等［62］的研究表明，辐射后肺癌细胞的外泌体中含有代谢酶ALDOA和ALDH3A1，通过加速糖酵解来增强非辐射肺癌细胞的迁移和侵袭能力。一项研究表明，HIF-1α稳定的长非编码RNA（HISLA）是一种被细胞外囊泡（EV）包装的lncRNA，通过EV从TAMs传递到肿瘤细胞，增强了乳腺癌细胞的有氧糖酵解和抗凋亡能力；机制上，HISLA与PHD2相互作用，抑制HIF-1α的羟基化和降解；此外，肿瘤细胞释放的乳酸上调巨噬细胞中的HISLA，在TAMs和肿瘤细胞之间形成一个前馈环路。这些结果表明，外泌体转移对于TME中多种细胞类型之间的细胞通讯是一种有用的方法。除了糖酵解，肿瘤代谢重编程还包括脂质、氨基酸和三羧酸循环代谢。外泌体也可能参与这些代谢过程［63］。CAFs分泌外泌体miR-522，通过靶向花生四烯酸脂氧合酶15（ALOX15）和阻断脂质-ROS的积累来抑制GC细胞中的铁死亡，从而支持肿瘤的进展和耐药性［59］。然而，TAMs衍生的外泌体是否参与这些过程尚不清楚，需要深入研究。

6 小结与展望

肿瘤细胞来源的外泌体可以通过运输生物活性物质反映出癌症的阶段，这使得外泌体可以作为诊断和预测临床预后的潜在标志物。TAMs是TME的重要组成成分，TME中各种信号通路和细胞影响TAMs的分化，其生物特性使其成为免疫治疗药物开发的重要靶点，通过深入研究癌症分子生物学，分子药物靶向治疗肿瘤取得突破性的进展。本文就TME中组成成分以及外泌体如何影响TAMs极化的表型、作用机制及其在结直肠癌治疗和预后中的潜在应用进行了综述。TME中的相关细胞分泌多种肿瘤相关的细胞因子形成利于肿瘤发展的环境，同时募集TAMs、促进TAMs极化为M2型巨噬细胞。在这些因素中，肿瘤细胞来源的外泌体所包含的miRNAs在促进巨噬细胞极化中起到了不可忽视的作用。与此同时TAMs的分泌产物也促进着肿瘤的发展，二者之间形成利于肿瘤发展的正反馈调节，这提示，可以将抑制TAMs的形成过程作为免疫治疗的靶点，或是探寻合适的分子标志物以此评价患者的预后情况。外泌体在促进TAMs形成中起到无法忽视的作用，这也为外泌体成为体外检测标志物提供了有力依据，对此有必要进一步深入研究外泌体的独特生物活性。因为除了对M1和M2巨噬细胞极化的影响之外，外泌体是否还参与了巨噬细胞其他表型的极化作用，或者某些特定的巨噬细胞亚群是否分泌了可以调节TME的独特的外泌体？这些仍然值得深入探讨，以期为找寻免疫治疗的靶点提供新的思路。之后我们会进行一系列的体外实验来证明外泌体对TAMs极化的影响并且希望能够阐明外泌体中的miRNAs是如何调节肿瘤的发生发展的。