免疫原性细胞死亡在肿瘤中的研究进展

王佩文，张小博

(江苏省南京市鼓楼区童家巷24号中国药科大学玄武门校区，江苏省肿瘤发生与干预重点实验室，江苏 南京 210009)

0 引言

免疫原性细胞死亡是一种调节性细胞死亡，能够激活适应性免疫应答。目前已经有多种药物和疗法被研究证明可以诱导免疫原性细胞死亡的发生，包括化疗药物，溶瘤病毒，光动力疗法等[1]。垂死或者应激状态下的细胞会释放某些分子，这些分子会作为免疫系统可识别的危险信号，这都被统称为损伤相关分子模式(Damage-associated Molecular Patterns，DAMPs)。当这些信号分子被先天模式识别受体所识别，则会激活Toll样受体和NOD样受体信号通路，有利于抗原提呈细胞的募集、活化、归巢、抗原摄取和成熟，从而激活下游肿瘤相关特异性免疫应答[2]。本文中主要讨论了免疫原性细胞死亡发生的相关概念、分子机制以及上下游相关的信号通路，主要强调了其在抗肿瘤免疫治疗中的应用意义。

1 免疫原性细胞死亡(ICD)发生机制

免疫原性细胞死亡(Immunogenic Cell Death，ICD)是药物在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，通过质膜成分的变化，释放可以被抗原提呈细胞识别的损伤相关分子信号，从而激活T细胞介导的适应性免疫反应，ICD的发生的机制主要在于钙网蛋白(Calreticulin，CRT)的暴露、胞外三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)的分泌以及高迁移率族蛋白B1(High-mobility group protein box 1，HMGB1)释放的增加[3]。

CRT通过内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)活化而暴露于细胞表面，这一般是由ICD诱导剂引发的，同时还会伴随着活性氧的产生以及ER应激反应，且其跨膜转位数量的变化与ICD呈正相关，当其被激活时会发生一系列变化，而这些微变化会率先由免疫细胞感知，例如树突状细胞感知到免疫原性的信号时，会吞噬应激和垂死的细胞，并刺激肿瘤特异性CD8T细胞的产生[4]。另外，CRT通过其表面表达的CD91作用于靶树突状细胞，以促进促炎细胞因子的释放并调节免疫抑制性Th17细胞的活性，CRT与CD91的结合有助于募集抗原提呈细胞，促进肿瘤特异性免疫应答[42]。

当肿瘤细胞发生ICD时，ATP会从胞内释放到胞外，充当垂死细胞释放的信号，这是抗肿瘤免疫反应所必须的，因此，ATP的消耗消除了细胞死亡的免疫原性[3]。而ATP的释放需要多种信号转导途径的激活[5]，其也依赖于细胞自噬，若自噬被干扰，则不能释放足够的ATP，从而无法引起肿瘤细胞外的免疫应答[6]。细胞死亡后，ATP 释放可继发于 caspase-3 或 caspase-7 介导的活性。化疗后，释放的 ATP 被树突状细胞上的嘌呤能 P2RX7 受体感知并诱导它们的募集。ATP 还通过激活 NLRP3 炎性体和随后分泌 IL-1β 来介导免疫刺激作用。这一步对于树突状细胞介导的细胞死亡免疫原性是必需的[36]。

HMGB1蛋白是高迁移率族蛋白超家族成员之一，在ICD晚期HMGB1释放到胞外[7]，有研究表明，HMGB1能够促使DC与肿瘤细胞表面的TLR4结合，并且其也可以与TLR4相互作用，这对于DC吞噬垂死的肿瘤细胞或DC的激活都是关键因素，这才便于激活特异性免疫应答[8]。另外还有研究表明，HMGB1与ATP协同诱导DCs释放IL-1β，并且针对HMGB1的抗体消除了DCs与垂死细胞相互联系时产生的IL-1β的能力[37]。而且还有很多研究证实HMGB1的免疫原性取决于其氧化还原状态，与非活化形式相比，HMGB1还原形式的有效促炎活性也证明了这一点[38]。有一项研究还证实，HMGB1与肿瘤浸润性DCs相互作用，抑制已确定肿瘤的小鼠的核酸介导的抗肿瘤活性[39]。

2 内质网应激(ERS)与ICD

未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)是内质网应激反应的一部分，ERS可以通过诱导蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R—like ER kinase，PERK)诱导该途径的激活，UPR是细胞响应ERS的自我保护的重要途径。UPR主要涉及的是三条通路：PERK-eIF2A信号通路、IRE1-XBP1信号通路和ATF6信号通路，在应激状态下，PERK、IRE1和ATF6三种蛋白便会与内质网分子伴侣GRP78蛋白分离而激活相应的通路，减轻未折叠蛋白或错误折叠的蛋白累积对细胞稳态平衡造成的损伤，恢复内质网稳态[9]。IRE1属于内质网I型跨膜蛋白，有蛋白激酶领域和核糖核酸内切酶活性，IRE1被激活，其会发生寡聚化和反式自磷酸化以激活其胞质RNase结构域，从而剪切XBP1的mRNA，产生成熟的剪切形式的XBP1[10]。ATF6 是一种 II 型跨膜蛋白，是bZIP转录因子家族的成员。ERS发生则ATF6会从GRP78释放，从而转移到高尔基体，经过切割释放出有活性的ATF6α片段，进入到细胞核内参与UPR基因的转录，诱导启动ER相关降解和细胞凋亡[11]。PERK是调节ERS的关键跨膜蛋白，在内质网内腔积聚未折叠蛋白后，PERK二聚和反式自磷酸化导致eIF2A激酶激活[12,13]。在PERK介导的eIF2A的磷酸化过程中，激活转录因子4(ATF4)可被激活[14,15]。大部分情况下，PERK信号通路是通过eIF2A磷酸化介导的，但也有研究表明，NRF2也可能是PERK激酶活性的底物，NRF2通过与微管相关蛋白Keap1结合分布在细胞质中，ERS发生时，PERK磷酸化NRF2导致其与Keap1分离，从而NRF2在核内积累[16]。

UPR在许多癌症中均会被激活，但在不同的肿瘤类型中，UPR的激活存在着差异，其过度激活时间过长和不足都不利于肿瘤的发展，IRE1-XBP1是三个UPR相关信号通路中最保守的[17]。研究发现，MYC通过与IRE1启动子和增强子结合直接转录激活IRE1-XBP1通路，MYC与XBP1s相互作用并调节其转录活性，而XBP1s不影响MYC转录活性。综合多个临床前乳腺癌模型结果分析可知，用IRE1 RNase抑制剂对IRE1 / XBP1途径进行抑制可防止MYC过度激活的肿瘤生长并使肿瘤对标准化疗敏感[18]。还有研究显示，IRE1-XBP1信号通路通过激活IL-6/STAT3信号传导来促进黑色素瘤发展[19]，且有研究提到ERS可由IRE1-XBP1通路介导的PHLDA3过表达加速肝细胞损伤[20]。

3 ICD与抗肿瘤免疫

在肿瘤微环境中，免疫原性细胞死亡在刺激功能失调的抗肿瘤免疫系统中起主导作用。先天免疫系统在激活导致肿瘤特异性免疫反应的适应性免疫中起着至关重要的作用。首先，在没有任何佐剂的情况下，肿瘤细胞发生ICD可以触发抗肿瘤免疫，从而保护小鼠免受同类型肿瘤细胞的攻击[40]。其次，体内诱导的ICD可以刺激局部抗肿瘤免疫，其会将免疫效应细胞吸引到肿瘤微环境中，导致至少部分依赖免疫系统的肿瘤抑制[41]。

有研究显示，GRP78介导的CD47调控可能是促进抗肿瘤巨噬细胞募集的分子驱动因子，通过ERS上调CD47的表达调控抗肿瘤免疫反应。CD47是一个在正常细胞和肿瘤细胞表面广泛表达的蛋白，可以与巨噬细胞表面的SIRPα相互作用，调节多种骨髓细胞的活性，保护正常细胞不被巨噬细胞吞噬。SIRPα/ CD47相互作用也参与了巨噬细胞迁移的调控，但其具体机制仍未知[21]。研究表明，JQ1通过诱导ICD在舌鳞状细胞癌(TSCC)中显示出治疗潜力，其可诱导eIF2A磷酸化，和钙网蛋白、HMGB1和ATP释放，JQ1预处理的垂死细胞可以保护小鼠免受肿瘤细胞的再次攻击，有效抑制了肿瘤的增殖并增加了CD3+/CD8+T细胞的肿瘤浸润[22]。研究发现，EPHB4受体表达下调会抑制SRC / MAPK / MYC通路，降低葡萄糖转运蛋白GLUT3的表达，导致葡萄糖摄取受损和细胞ATP水平降低，并与ERS激活和肿瘤细胞发生ICD有关[23]。RIG-I类解旋酶(RLH)是用于病毒RNA诱导I型干扰素产生的胞质传感器，可识别病毒RNA种类，可被合成RNA激活，启动由IRF，MAPK和NF-κB介导的信号级联反应，导致I型IFN和免疫应答基因的产生。研究人员在胰腺癌小鼠模型中发现，RLH配体进行治疗可诱导有效的抗肿瘤免疫活性，并证实了RLH的激活与免疫原性肿瘤细胞死亡有关[24]。

Hemidesmus indicus是近年来被发现的一种有前途的抗癌植物药，研究人员发现其具有刺激人结肠癌细胞系产生ICD的能力，其表现为CRT的暴露、HSP70表达的增加以及ATP和HMGB1的释放，本研究中发现在亚毒性浓度下，其可以诱导DC轻度激活，在癌症免疫治疗方面存在潜力[25]。人参皂苷Rg3是具有抗肿瘤和免疫调节活性的人参皂苷，有研究验证了其在基于DC诱导免疫原性肿瘤细胞死亡中的重要性，Rg3通过诱导凋亡使钙网蛋白和热休克蛋白在内的免疫原性死亡标志物的表达和相关基因的转录增加，CRT的表达与DC对垂死肿瘤细胞的摄取成正相关[26]。

近年有项研究将ROCK抑制剂与ICD诱导剂相结合使用，ROCK抑制剂可以增强吞噬细胞清除癌细胞的能力并有助于增加DC介导的T细胞启动，诱导抗肿瘤免疫力，从而抑制肿瘤生长。将ROCK抑制剂与免疫原性化学疗法相结合可导致DC成熟度提高、CD8 +细胞毒性T细胞协同增效以及肿瘤浸润，这种治疗策略可有效抑制肿瘤生长并提高总体生存率[27]。PD-1检查点抑制剂的一个突破点就是在于缺氧肿瘤微环境中很少有肿瘤特异性T细胞免疫浸润，大多数肿瘤对此疗法还具有耐药性，而在与ICD诱导剂联合使用后，则可以改善T细胞对不同肿瘤的反应，使肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感[46]。在用PD1单抗和Dinaciclib联合治疗后，Dinaciclib处理的细胞表现出明显的ICD特征，联合治疗的小鼠肿瘤的T细胞浸润和DC活化明显增加，表明这种联合疗法确实可以提高PD-1单抗免疫疗法的作用[47]。

癌症免疫疗法的宗旨就是激活自身免疫系统从而起到特异性抗肿瘤作用，目前越来越多的研究证实ICD在抗肿瘤免疫上的治疗潜力，从某些程度上我们或许可以发现更多的ICD诱导剂或是将非ICD诱导剂转化为有效的ICD诱导剂，开发出它们在肿瘤中更多的效用。

4 ICD诱导剂在肿瘤中的应用

许多研究发现，蒽环类药物、奥沙利铂等可以诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡，他们的共同特征就是诱导ERS和ROS产生，而具有显著抗癌活性的天然化合物诱导ICD的研究还较少[28]。蒽环类药物通过释放ATP诱导骨髓细胞的肿瘤浸润，从而刺激具有炎性特征的树突状细胞的局部分化，该类细胞可以提呈信号给T细胞，诱导抗肿瘤免疫反应。此外，蒽环类药物治疗死亡的肿瘤细胞释放的ANXA1需要与树突状细胞上的FPR1相互作用，以引发T细胞介导的抗肿瘤免疫[49]。近年来也有植物来源的天然化合物被证明有作为ICD新型诱导剂的潜力，例如紫草素、强心苷等。紫草素可以有效激活受体和线粒体介导的细胞凋亡，并增加所得肿瘤细胞裂解物中DAMPs的表达，从而导致免疫原性细胞死亡的发生，在联合LPS的额外刺激可将DC激活至完全成熟，增强肿瘤特异性免疫应答[29]。强心苷能够有效诱导ICD并以此将死亡的癌细胞转化为刺激抗肿瘤反应的疫苗，这种作用与抑制细胞膜中的钠钾依赖性三磷酸腺苷酶有关[30]。紫杉醇诱导内质网应激，在体外可以诱导小鼠卵巢癌细胞CRT暴露，ATP释放，HMGB1释放，CXCL10上调和ANXA1暴露，触发蛋白激酶R样ER激酶激活和真核翻译起始因子2α磷酸化，其可以依赖于TLR4通过ICD激活抗肿瘤免疫，并在原发性卵巢肿瘤中诱导T细胞浸润[48]。

有研究证明，汉黄芩素(Wogonin)能够通过ROS介导的ERS，激活PI3K/AKT通路诱导CRT/ Annexin A1细胞膜移位和HMGB1的释放[31]。还有研究证实，在异种移植肿瘤模型中，汉黄芩素抑制肿瘤生长并促进DC成熟、募集免疫细胞到肿瘤组织中，并且其直接抑制肿瘤细胞中STAT3的激活，STAT3的去磷酸化有助于降低B7H1和MHC I类链相关蛋白A的表达，并增强细胞膜上CRT的表达[32]。溶瘤新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)会触发ICD并引发抗肿瘤免疫力，研究发现NDV感染的肺癌细胞表面CRT表达增加和HMGB1和HSP70 / 90的释放，且肺癌细胞中自噬相关基因的消耗显著抑制了NDV诱导的ICD作用，研究证明了NDV是强效的ICD诱导剂，这也说明了自噬是NDV诱导肺癌细胞发生ICD的重要原因[33]。与之相关还有研究显示，STAT3有助于NDV诱导的黑色素瘤细胞ICD发生，同时也证明了细胞凋亡、自噬、坏死和内质网应激都对NDV诱导的黑色素瘤细胞ICD有促进作用[34]。阿霉素也是一种ICD诱导剂，现被广泛用于NP制剂，目前已有研究提出将阿霉素加载到高度整合的介孔二氧化硅NPs中，开发了一种pH和GSH双重敏感的递送系统，用于全身治疗高度转移性三阴性乳腺癌，从而诱导树突状细胞的成熟和抗肿瘤细胞因子的释放[45]。

此外，金丝桃素的光动力疗法已被证实可以诱导phox-ER应激，从而导致ecto-CRT的表达、ATP的主动分泌和热休克蛋白的被动释放，例如HSP70、HSP90，在晚期细胞凋亡中，可以通过在非免疫小鼠中诱导ICD来抑制肿瘤生长[35]。而且除了诱导ICD直接杀死肿瘤细胞，还能产生类似疫苗的方法用于刺激“冷”肿瘤微环境向免疫原性“热”肿瘤微环境转变，比如刚提到的光动力疗法，以及放射疗法和光热疗法等，这都可以有助于引发更广谱的抗原特异性免疫反应，增强免疫刺激反应，更好的起到抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤浸润的免疫抑制作用[43]，目前ICD疗法还与新兴的纳米粒子结合起来，可以实时监测定位和治疗效果，并作为佐剂或免疫增强剂[44]。因此近年来，越来越多人开始投入研究ICD诱导剂，而且从各种研究证据来看，ICD诱导剂联合治疗具有更深远的临床和治疗意义。

5 小结与展望

综上所述，免疫原性细胞死亡为提高癌症治疗提供了更多的机会和可能性，但目前很多ICD还是在小鼠模型上进行的验证，临床模型上的证据还不是那么充足，因此还是需要进一步的研究，以说明ICD诱导剂在临床中的实用性。未来在应用抗癌药物治疗的同时，可以考虑使用ICD诱导剂进行组合疗法，克服临床药物治疗中产生的耐药性，使得患者能从新型疗法中获得益处。另外，也可以开发更多理想的ICD诱导剂，从而为改良肿瘤疫苗接种策略开辟了前景。