骨关节炎细胞自噬机制的相关药物研究进展

袁长深，李哲，韦晓芸，容伟明，官岩兵，梅其杰，段戡

(1.广西中医药大学第一附属医院骨三科，南宁 530023； 2.广西中医药大学，南宁 530000)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以软骨细胞减少、软骨下硬化和滑膜炎为特征的退行性关节疾病，衰老、肥胖、关节损伤及遗传等是OA发生的主要风险因素[1]。随着老龄化社会的加剧及肥胖症患者的不断增加，OA发病率正逐年上升[2-3]。OA防治已成为全世界亟须解决的公共卫生问题和社会问题。目前药物治疗仅能改善疾病症状，尚无有效方法阻止OA进程，一些国家将OA防治作为区域卫生政策的优先事项对待，甚至建议通过修订有关OA临床和公共政策加以重视[4]。因此，深入研究OA发病机制对于探索新的治疗靶点至关重要。

OA发病原因尚不明确，其主要病理表现为软骨细胞凋亡和细胞外基质丢失；维持软骨正常的生理结构和功能是治疗OA的关键。自噬作为一种重要的细胞稳态机制，可通过清除受损和功能失调的细胞器和大分子维持OA软骨内环境的稳定。自噬通过增强体内平衡机制，可有效减缓OA软骨退变和降低OA风险[5]。因此，使用药物增强OA自噬、延缓OA进程成为OA治疗的新的研究热点。目前有关OA自噬的研究尚处于起步阶段，关于药物调控OA自噬的研究报道很少。现对OA细胞自噬机制的相关药物研究进展予以综述，以期为OA自噬研究提供新思路。

1 OA自噬的机制

自噬是细胞“回炉重造”的过程，通过将部分受损或老化的细胞质及细胞器隔离到一个双层膜囊泡后转运至一个可降解的细胞器中，分解产生代谢物并回收利用，以满足细胞自身代谢需要和某些细胞器的更新[6]。

unc-51样激酶1、Beclin1和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)在正常人和小鼠关节软骨中均有表达[7]，且正常成人软骨中的适度自噬不仅能够控制软骨细胞的成熟速度，还能够对软骨细胞生命周期的末期阶段进行调节[8]。在OA退变的初始阶段，受到分解代谢、氧水平及营养水平等变化的影响，自噬会应激性增加。短暂增加的自噬只是作为一种适应性补偿反应，对软骨健康起积极作用；而随着OA病情的不断加重，应激性增加的自噬难以继续代偿，导致OA退变进一步加重[9]。OA中晚期，软骨中LC3、Beclin1、unc-51样激酶1、自噬相关基因5表达下降，细胞凋亡增加，细胞外基质合成减少[7]。由于自噬水平下调，软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白(collagen type Ⅱ，Col Ⅱ)、聚集蛋白聚糖基因和相关蛋白表达下降，基质金属蛋白酶13、带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解聚蛋白样金属蛋白酶5基因表达上调，OA进展加速[7,10]。通过活细胞荧光示踪技术也发现，软骨细胞自噬受到抑制后，引起大量Col Ⅱ前体在内质网蓄积，导致软骨基质中Col Ⅱ纤维结构形成缺失，说明软骨细胞自噬调控Col Ⅱ分泌，影响软骨基质正常结构[11]。自噬参与OA发病，影响OA发展进程，是维持软骨细胞健康状态的重要机制。因此，从软骨细胞自噬着手，通过激活软骨细胞自噬活性，可有效逆转自噬失代偿状态，为防治OA退变提供了一种有效方式。

2 调控OA自噬的相关药物

目前使用传统药物治疗只能改善OA症状，并不能有效截断或逆转OA病程进展。随着对自噬的深入研究发现，在适当时间激活自噬能有效延缓OA退变，因此针对OA自噬的相关药物研究陆续开展，并获得了一定的治疗效果。

2.1中药复方 中药复方通过药物多靶点发挥作用治疗OA，但存在干扰因素多、作用机制复杂、研究难度较大等特点。近年来，使用中药复方调控自噬治疗OA的研究不断增加，为OA自噬作用机制提供一定的理论依据。

2.1.1四妙散 四妙散是治疗OA湿热阻络、寒湿痹阻证的经典方剂。目前研究多为临床观察，对其作用机制的研究甚少。既往认为，四妙散治疗OA的作用可能与降低炎症因子有关[12]。研究表明，四妙散可能通过激活自噬抑制软骨细胞凋亡，发挥对OA的防治作用。沈金明等[13]通过前交叉韧带切断术建立膝OA大鼠模型，发现模型组软骨细胞凋亡相关蛋白Fas相关死亡结构域蛋白、胱天蛋白酶3的表达水平较正常组升高，自噬相关蛋白LC3表达降低；而使用四妙散干预后，Fas相关死亡结构域蛋白、胱天蛋白酶3表达显著降低，LC3表达升高，表明四妙散通过激活软骨细胞自噬延缓膝OA退变，这为研究四妙散对OA的作用机制提供了新的参考点。

2.1.2右归丸、右归饮 右归丸、右归饮是治疗阳虚寒凝型OA的代表方，疗效确切，可降低血清中炎症因子的表达[14-15]、减缓软骨组织Col Ⅱ丢失[16]或抑制Wnt信号通路[17]、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)/核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路[18]。

右归丸、右归饮治疗OA的作用机制可能与自噬关系密切。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是自噬的主要负调控因子，而Beclin1在软骨中低表达，研究认为，mTOR和Beclin1可能是治疗OA的新靶点。颜春鲁等[19]使用改良Hulth法建立动物模型，在手术造模6周后使用低、中、高剂量的右归丸干预8周发现，软骨细胞中PI3K、磷酸化的Akt和磷酸化的mTOR等蛋白的表达明显降低，自噬相关因子Beclin1表达升高，且高剂量组效果佳，提示右归丸可能通过调控自噬对OA发挥作用。同时，OA中炎症因子和基质金属蛋白酶大量表达，其与自噬通路激活的相关性尚不明确。为明确自噬与炎症因子的关系，黄杨等[20]直接从滑膜入手研究OA，结果发现，右归饮也可抑制OA中mTOR的表达，并增强Beclin1的表达，降低血清炎症因子[白细胞介素(interleukin，IL)-1β、肿瘤坏死因子-α等]水平，缓解OA模型炎性浸润，减少软骨破坏。

右归丸、右归饮治疗OA的具体作用机制尚不明确，但动物研究均显示，高剂量右归丸、右归饮治疗组的OA治疗效果最佳[14-19]。因此，药物剂量可能是右归丸、右归饮有效治疗OA的关键，但其最低有效治疗剂量尚不清楚，可能成为未来研究的关注点。

2.1.3新风胶囊 新风胶囊具有抗炎镇痛的作用，可有效改善OA患者症状、提升OA患者生活质量，可能与增强膝OA患者外周血B、T淋巴细胞衰减因子表达、降低T细胞活化、减轻炎症和氧化应激损伤有关[21]；此外，通过抑制NF-κB信号通路降低炎症反应可能也是其作用机制[22]。动物实验发现，与膝OA模型对照组相比，在使用临床患者10倍用量的新风胶囊剂量灌胃1个月后，新风胶囊组膝OA大鼠免疫球蛋白G1、免疫球蛋白G2α、肿瘤坏死因子-α表达降低，IL-4及自噬相关基因表达升高，软骨细胞形态、细胞器、线粒体等趋于正常[23]，说明新风胶囊可抑制OA炎症、调节自噬水平，可防治OA。

2.1.4桃仁膝康丸 桃仁膝康丸具有祛风湿、止痹痛、补肝肾的功效，可有效缓解OA早期症状，通过提高超氧化物歧化酶活性降低血清丙二醛及一氧化氮水平，减轻氧自由基对软骨的损伤，缓解炎症反应，从而有效激发软骨细胞功能恢复及软骨再生，达到保护软骨的目的[24]。鉴于氧化应激与自噬关系，有学者尝试从自噬探讨其作用机制。秦娜等[25]通过采用改良Hulth法制造动物模型，使用桃仁膝康丸干预OA大鼠模型12周，结果显示，桃仁膝康丸组OA大鼠模型软骨中unc-51样激酶1、LC3-Ⅱ和Beclin1等自噬标志蛋白的表达明显升高；而桃仁膝康丸+自噬抑制剂3-甲基丙烯酸甲酯组unc-51样激酶1、Beclin1和LC3-Ⅱ表达部分抑制，提示桃仁膝康丸可通过激活OA自噬延缓或阻止OA软骨退变。上述研究揭示了桃仁膝康丸的分子机制，为桃仁膝康丸的临床应用提供了基础药理学依据，但自噬的调节过程复杂，桃仁膝康丸激活OA自噬的机制仍需深入研究。

2.2中药提取物 与中药复方相比，中药提取物在OA自噬中的作用更易理解，因此对中药提取物在OA自噬中作用的研究相对较多。中药有效成分调控OA自噬试验的不断开展有助于阐明中药提取物调控OA自噬的作用机制。

2.2.1姜黄素 姜黄素是治疗OA的有效药物，能改善视觉模拟评分及西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数量表评分，且副作用低[26]。姜黄素通过影响炎症、凋亡和氧化途径作用于OA，主要与抑制NF-κB信号通路[27]、释放核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体[28]、下调间充质溶解素表达[29]、阻断线粒体依赖的凋亡途径[30]、激活促进沉默信息调节因子2相关酶1、抑制内质网应激[31]、激活酪氨酸蛋白激酶2/信号转导及转录活化因子3信号通路[32]有关。另有报道认为，姜黄素与外泌体关系密切[33]。

自噬是姜黄素治疗OA不可或缺的机制之一。体外实验表明，IL-1β干预的软骨细胞活力下降；姜黄素干预后，IL-1β对软骨细胞生长的抑制作用改善，其可激活促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信号调节激酶1/2通路，上调胞外信号调节激酶1/2、LC3-Ⅱ及Beclin1的表达，以诱导细胞自噬[34]。动物研究显示，姜黄素可提高动物模型中自噬相关标志物LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin1的表达，抑制mTOR(Ser2448)和Akt(Ser473)的磷酸化，证实姜黄素可通过Akt/mTOR途径调控OA软骨细胞自噬，减少软骨细胞凋亡[35]。姜黄素治疗OA的生物利用度较低，限制了其临床应用[36]。未来应深入探索姜黄素治疗OA的作用机制，明确其最佳使用方式及治疗剂量，以广泛应用于临床。

2.2.2青藤碱 青藤碱具有消炎、镇痛、免疫抑制等作用，广泛用于OA治疗，但其具体作用机制尚不明确。有报道称，青藤碱可激活核转录因子红系2相关因子2/血红素加氧酶1信号通路，抑制小鼠软骨细胞NF-κB活性[37]；并可能通过激活miR-223-3p抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体信号转导[38]。为进一步探明青藤碱治疗OA的机制，郑洁等[39]成功建立OA模型后，对低、中、高剂量青藤碱组分别注射10次低、中、高剂量盐酸青藤碱注射液，结果显示，中、高剂量青藤碱组LC3-Ⅱ和Beclin1表达显著高于模型组及低剂量青藤碱组，且PI3K、Akt和mTOR等表达下调，提示中、高剂量的青藤碱可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路调控OA关节软骨自噬。

2.2.3冬虫夏草素 冬虫夏草素是中药蛹虫草中分离出的一种天然核苷类似物，具有促进细胞分化和抗凋亡等功能，在防治OA中起重要作用。既往认为，冬虫夏草素通过抗炎作用保护关节软骨[40]。夏晨[41]的研究发现，冬虫夏草素能有效逆转OA软骨损伤，与激活自噬、抑制软骨机制降解密切相关，为冬虫夏草素防治OA提供了重要的理论依据。

2.2.4芍药苷 芍药苷具有抗炎、抗氧化、免疫调节等作用，可能通过抑制凋亡和炎症防治OA[42-43]。自噬也是芍药苷的重要机制之一，姚旭等[44]将人软骨细胞C28/I2进行培养，经IL-1β诱导软骨炎症时，细胞内LC3-Ⅱ和Beclin1表达下降。经芍药苷处理后，LC3-Ⅱ和Beclin1的表达增加，磷酸化PI3K和磷酸化Akt表达降低；而3-甲基丙烯酸甲酯可部分拮抗磷酸化PI3K和磷酸化Akt蛋白的降低，提示芍药苷通过抑制PI3K/Akt通路促进软骨细胞自噬，减轻软骨细胞损伤。

2.2.5其他中药提取物 Liu等[45]认为，黄芪甲苷可通过激活软骨细胞自噬活性逆转IL-1β对细胞增殖的抑制，并促进细胞凋亡；黄芩苷通过miR-766-3p/重组人线粒体凋亡诱导因子1轴激活自噬，上调Beclin1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，从而减轻IL-1β诱导的OA软骨细胞凋亡和细胞外基质降解[46]。Jiang等[47]研究发现，双氢青蒿素可能通过抑制NF-κB途径激活自噬。

2.3现代医学药物 现代医学使用药物调控OA的历史悠久，但通过自噬研究药物对OA的疗效仍处于初步阶段。减轻药物毒性可能是未来通过提高不同药物诱导软骨细胞自噬的能力，进而提高药物的生物利用度的研究方向，将为未来临床应用提供坚实的理论基础。

2.3.1氨基葡萄糖 氨基葡萄糖是关节软骨的天然组成成分，也是软骨细胞的营养素，存在于关节软骨及关节滑液中。人体内氨基葡萄糖缺乏的严重程度与年龄呈正相关，故认为合理补充氨基葡萄糖(1 500 mg/d)可改善OA症状[48]，并可有效预防早期、中期膝OA的发生；长期服药(超过3年)可显著降低关节结构变化的进展[49]，从而治疗OA。

氨基葡萄糖治疗OA的有效性可能与激活OA软骨细胞自噬密切相关。自噬初始阶段存在代谢和饥饿应激状态[50]。Caramés等[51]在体外实验中使用氨基葡萄糖(0.1～10 mmol/L)处理人正常软骨细胞，发现LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈剂量依赖性增加，表明氨基葡萄糖可激活正常人软骨细胞的自噬；而在体内实验中，饥饿状态或腹腔注射氨基葡萄糖均能激活绿色荧光蛋白-LC3转基因小鼠的自噬，小鼠软骨中绿色荧光蛋白-LC3信号随食物限制和腹腔注射氨基葡萄糖而显著增加，但腹腔注射氨基葡萄糖小鼠的自噬水平明显升高，表明氨基葡萄糖是体内外自噬的有效激活剂。

氨基葡萄糖对软骨细胞自噬具有时间依赖性的双重作用，即短期内氨基葡萄糖可激活自噬(称为短期反应)，但长期使用可抑制自噬反应(称为长期反应)，临床上存在氨基葡萄糖剂量差异导致治疗效果截然不同[52-54]，说明氨基葡萄糖有效剂量及治疗时间可能是其治疗OA的关键[55]。氨基葡萄糖治疗OA的Meta分析表明，氨基葡萄糖治疗OA有效，但其疗效异质性尚不明确[56]。

2.3.2糖皮质激素 对于重度疼痛或治疗后疼痛无缓解甚至持续加重的OA患者，建议关节腔内注射糖皮质激素，以短期缓解疼痛，但不宜多次注射[57]。长期、反复或大剂量使用糖皮质激素可因自噬诱导过度而导致细胞活力降低，从而改变软骨代谢，加速软骨细胞凋亡，加重OA病情。

自噬可能是糖皮质激素治疗OA的重要机制之一。体外实验发现，1 μmol/L或40 μmol/L地塞米松处理N1511软骨细胞24～48 h，N1511软骨细胞的存活率无明显变化，而200 μmol/L和1 μmol/L地塞米松能明显降低N1511软骨细胞的存活率；使用100～400 μmol/L的3-甲基丙烯酸甲酯可明显改善200 μmol/L或1 μmol/L地塞米松引起的N1511软骨细胞活力降低，表明地塞米松可通过自噬降低N1511软骨细胞活力[58]。为明确上述机制，Liu等[59]进行深入研究发现，地塞米松作用于软骨细胞6 h后，软骨细胞自噬能力增强，24 h后达到最大值，而地塞米松持续暴露导致软骨细胞自噬活性下调，说明短期糖皮质激素治疗可激活自噬，但长期糖皮质激素治疗的效果较差，这可能与GC诱发细胞衰老[60]、导致细胞功能失调、诱发细胞凋亡相关。因此，糖皮质激素与自噬作用及自噬调控可能是未来防治糖皮质激素长期治疗副作用的重点研究方向。

2.3.3雷帕霉素 mTOR是自噬的负性调控因子，在自噬过程、多种分子作用机制及信号调控通路中起关键作用，而雷帕霉素是mTOR敏感性最高的抑制剂之一。体外实验显示，经雷帕霉素(100 nmol/L)预处理1 h后使用IL-18处理24 h的软骨细胞自噬相关蛋白7的水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显提高，而p62水平降低；此外，凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白表达和胱天蛋白酶3/9的活性降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加，表明雷帕霉素可通过恢复被抑制的自噬活性有效防止IL-18诱导的软骨细胞凋亡[61]。

体内实验证实，连续10周腹腔注射雷帕霉素OA模型小鼠的软骨细胞数量明显增加，mTOR复合物1下游靶点核糖体蛋白S6的磷酸化水平降低；LC3抗体染色显示，雷帕霉素处理后，LC3表达增加，软骨自噬明显激活，表明雷帕霉素可通过激活自噬降低实验小鼠OA的严重程度[62]，这为进一步研究雷帕霉素调控OA自噬提供了理论依据。

2.3.4帕瑞昔布 帕瑞昔布是新型非甾体抗炎药，副作用少、针对性强，不仅具有传统非甾体抗炎药消炎镇痛的作用，还能够有效保护关节软骨，目前帕瑞昔布多用于镇痛，但对其在OA中作用机制的研究甚少。有学者试图探究帕瑞昔布能否通过自噬对OA起作用，通过Hulth法造模，对治疗组连续12周腹腔注射帕瑞昔布，结果显示，治疗组OA软骨的损伤明显减轻、Mankin评分降低、自噬相关蛋白Beclin1表达量升高，提示帕瑞昔布可能通过增强软骨细胞自噬延缓OA退变[63]。这为新型非甾体抗炎药的使用提供了新思路。

2.3.5其他 二甲双胍通过升高AMP活化的蛋白激酶α磷酸化水平上调沉默信息调节因子1的表达，增加自噬对OA的保护作用[64]。飞燕草素可通过激活自噬保护氧化应激时的软骨细胞损伤[65]；而花青素则可通过激活自噬减轻过氧化氢诱导的大鼠软骨细胞损伤[66]。此外，多种药物可通过调控自噬作用于OA。

3 小 结

目前OA的发病机制尚不明确，药物治疗主要以对症治疗为主，而自噬在OA防治中起重要作用。利用药物调控自噬可有效延缓OA发展进程，这可能成为防治OA的新方法，亦可能是未来防治OA的有效途径。目前药物调控OA自噬的研究多集中于动物研究阶段；临床研究仍以单中心研究为主，缺乏评估药物疗效的多中心、大样本随机对照研究，因此进行多中心、大样本随机对照研究，减少样本异质性，精准调控自噬可能是未来的研究方向。