基因修饰猪作为异种器官移植供体在克服免疫排斥反应中的研究进展

王 飞，王 宁

（雅安职业技术学院，四川 雅安 625000）

近年来，随着医疗技术的成熟，免疫生物学的发展，器官移植成功率的大幅提高，器官移植已成为许多终末期疾病首选的治疗方法。但是，接受移植手术的人数日益增加，而能够提供的供体器官数量却非常有限，大部分患者得不到及时治疗在等待器官的过程中死亡。由此产生的器官短缺问题日渐凸显，已成为制约临床器官移植发展的重要因素，动物器官来源丰富，数量庞大，用动物器官作异种供体是一种有效解决来源的途径，致使关于异种器官移植（Xenotransplantation）的研究迅速蓬勃发展。

灵长类动物，如黑猩猩、狒狒、猴子等，进化程度与人相近，且这些灵长类动物中有着与人类相似的A、B血型和主要组织相容性复合物，从理论上讲，这些高级的非人类灵长类动物是用于异种移植的最理想的供者动物，但它们繁殖周期长、饲养困难，濒临灭绝、价格昂贵，从伦理和物种保护出发不适合作为异种器官供体。猪凭借解剖学和生理学特征与人的高度相似性，且易于基因改造和修饰、安全性好，逐渐取代了其他模式动物的地位，成为异种器官移植研究的最佳供体动物。然而，由于猪和人类之间在进化上的巨大差异，直接用猪作为异种器官移植的供体会产生强力的免疫排斥反应，主要表现为超急性排斥反应、急性血管排斥反应等。要解决这些免疫排斥反应实现异种器官移植，Starzl T E等预测，通过基因工程进行遗传修饰或其他调节技术改造的动物器官，将成为器官移植的最终发展趋势。

目前，通过敲除异种抗原基因，转入表达人体补体调节蛋白和凝血调节蛋白等特点的基因获得的基因修饰猪，能够克服异种移植免疫排斥反应，可延长猪来源供体器官在非人灵长类动物受体中的存活时间。本文就基因修饰猪作为异种器官移植供体在克服各阶段免疫排斥反应的研究进展作一综述。

1 超急性排斥反应

超急性排斥反应（Hyperacute Rejection，HAR）是指当异种细胞、组织或器官作为供体移植到宿主体内，发生的快速而又强烈的免疫排斥反应，表现为异种供体刚与受体血管吻合，在器官尚未发挥功能时就与体内存在的天然抗体结合，通过激活体内免疫系统攻击供体器官。目前普遍认为，HAR是由人体内天然存在的抗体IgG和IgM与非灵长类动物细胞表面的α1，3-半乳糖基（α1，3-galactosyl，α1，3Gal）抗原决定簇结合引起，它是异种器官移植过程中面临的主要障碍。α1，3Gal抗原表位的形成受α1，3-半乳糖苷转移酶（α1，3-galactosyltransferase，GGTA1）基因调控，人类在进化过程中GGTA1基因失活，细胞表面不表达α1，3Gal但却形成了天然α1，3Gal抗体，而非灵长类动物自身表达α1，3Gal，当把动物器官移植到人类受体时，人体血液中的天然抗体就会与异种抗原结合，形成抗原抗体复合物激活补体调控系统，引发补体系统的链式激活最终形成攻膜复合物，使器官在数分钟到数小时内发生炎症、血栓、坏死等症状。

为解决异种器官移植中的HAR，在Lai LX等（2002）制备了首例GGAT1单等位基因敲除（GGTA1+/-）的基础上，Phelps CJ等（2003），Kolber-Simonds等（2004）成功获得了GGAT1基因失活（GGTA1-/-）的基因修饰猪。GGAT1敲除猪（GTKO）的成功为异种器官移植的发展奠定了基础，之后关于GGAT1基因敲除猪的报道越来越多，关于GTKO的猪用于器官移植后的结果也越来越好。如Yamada K等用肾移植到狒狒后，在体内存活了32d，Kuwaki K等用心脏移植到狒狒后存活了78d。

2 急性血管排斥反应

如果HAR能得以克服，在移植后2～3d内会发生急性血管性排斥反应（Acute Vascular Rejection，AVR），其症状主要表现为移植处巨噬细胞和自然杀伤细胞（带有少量的T细胞）的炎性浸润和活化，细胞因子的释放和血管内皮活化，血管内血栓形成，血管壁纤维素样坏死等。有研究表明AVR的形成需要内源蛋白的合成和受移植器官内皮细胞和宿主抗体、巨噬细胞和血小板相互作用的驱动。新内源蛋白的合成使Ⅱ型内皮细胞活化，活化的内皮细胞一方面刺激内皮细胞表达粘附因子，如细胞粘附分子-1（Vascular cell melhesion molecule-1）和细胞因子IL-1，IL-6，IL-8等，这些细胞因子与T细胞的活化及增殖都密切相关。另一方面打破血栓调节素平衡，使血小板活化产生促凝血的（Platelet-Activating Factor，PAF）和组织因子导致血管内血栓形成。此外，α1，3Gal抗原表位在起始诱导AVR的过程中也发挥着作用，在敲除GGAT1基因的动物器官中，α1，3Gal抗原表位不表达会诱导非α1，3Gal抗体的急剧上升，从而引发AVR。

目前认为AVR的发生主要与补体活化有关，Nagaharna M等（2002）用腺病毒介导的方法将DAF、MCP、CD59基因转入猪细胞，获得了同时表达三个基因的克隆猪，在肝的灌注实验中有效抑制了补体系统的激活。Loveland BE等（2004）构建hCD46表达载体，并通过体细胞核移植技术获得了高表达hCD46的猪，成功分离猪外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）用于血清裂解实验，发现高表达hCD46的PBMC有效抵抗人类补体的损伤，将肾移植到狒狒后其存活时间也远远超过普通猪。Mohiuddin等 利用CD40抗体，将敲除GGTA1基因和过表达两种人体蛋白基因的猪心脏移植到狒狒体内，结果显示平均存活时间为

298 d，最长的1只已经存活了945d。

3 细胞性排斥反应

超急性排斥反应和急性血管排斥反应都是体液免疫的结果，而细胞性排斥反应（Cellularre Rejection，CR）是由细胞免疫导致。CR主要受自然杀伤细胞（Natural Killer Cell，NK cell）和主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）激活T淋巴细胞介导。CR的形成主要决定于多肽的类型，不同的MHC会激活不同的T细胞，Ⅰ类MHC主要激活CD4+T细胞而Ⅱ型MHC主要激活CD8+T细胞。

Wu等研究发现猪-动物移植模型后，发现Treg数量降低与排斥反应的发生紧密相关，耐受组淋巴细胞分类中调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）比例显著升高，清除Treg会显著提高异种排斥反应的发生率。

4 慢排斥反应

慢排斥反应（Chronic rejection）即移植物血管病变，是一种缓慢和渐进性的排斥反应，由于异种器官移植后很难生存到此阶段，所以对慢排斥的研究甚少，但确定此阶段抗体反应和补体系统的激活已不存在。Mohiuddin等的研究显示表达人血栓调节蛋白（humanthrombomodulin，hTM）的GTKO基因修饰猪，进行心脏移植后没有出现移植物血管病变。IWASE H等的研究表明，表达hTM的GTKO基因修饰猪，hTM的表达会阻止血小板减少，延缓血栓形成和消耗性凝血病的发生，更有利于异种器官移植。

5 猪的基因修饰对异种器官移植的促进

随着现代生物技术的发展，传统的基因修饰技术已逐渐被锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）技术、转录激活因子样效应核酸酶（Transcription Activator Like Effectors Nuclease，TALEN）技术、CRISPR／Cas9技术等取代。基因修饰技术的快速发展，促进了猪人源基因的改造，实现了免疫排斥反应的降低，缩短了异种移植进入临床的时间。

6 小结

异种移植是解决人类器官短缺问题的重要手段，也是近年来学者不懈研究的领域。虽然临床异种移植尚无成功的经验，但是灵长类动物的前期研究将为异种器官移植提供重要的试验和数据理论支撑。近年来，异种移植基础研究进展迅速，猪内源性逆转录病毒感染问题也得到了解决，基因修饰猪作为异种器官移植供体在受体内的存活时间也显著延长。相信随着各种基因修饰猪的产生，免疫抑制药物的发展，异种器官移植面临的免疫排斥反应将有效得到解决。