马梨形虫病及其诊断方法

刘文光

（内蒙古鄂尔多斯市伊金霍洛旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 鄂尔多斯 017200）

马梨形虫病又称血孢子虫病或焦虫病，是通过媒介蜱传播而引发的一种马属动物红细胞内的血液原虫病。该病的主要症状为急性溶血性贫血、呼吸受阻、高热以及黄疸等，若发生急性感染，马匹极容易死亡。近年来，随着科学技术水平的不断提升，已逐步建立一套较为完善的马梨形虫病诊断技术，为马梨形虫病的防治奠定了坚实的基础。

1 马梨形虫病概述

1.1 病原特点

马梨形虫病是由硬蜱传播巴贝斯科和泰勒科原虫引起的血液原虫病，病原属顶复器门梨形虫纲梨形虫目巴贝斯科和泰勒科。不同种虫的形态特征存在差异。常见的形态有圆形、梨形、杆形、阿米巴形。它们常寄生于哺乳动物红细胞内。泰勒虫还寄生于白细胞或组织细胞内。石榴体为多核虫体，是在组织细胞或白细胞内裂殖生殖形成的裂殖体。常见的病原体包括双芽巴贝斯虫和泰勒虫。

1.1.1 基体形态

（1）双芽巴贝斯虫大型梨形虫，长度大于红细胞半径；形态多样，包括圆形、梨籽形、球形等；典型虫体为两个梨籽形虫体，以尖端相对形成锐角；寄生于红细胞中央，染色质位于虫体边缘；每个红细胞内寄生数量为1～3个，特殊情况为6～7个。

（2）泰勒虫病 小型梨形虫，大小为1.5～2.1μm×0.7μm，小于红细胞半径；形态多样，包括圆形、梨籽形、球形等。

1.1.2 生活史 梨形虫以蜱虫作为传播媒介，其生活史相对复杂。虫体多选择在红细胞内以成对出芽的形式繁殖。寄生有梨形虫的红细胞被蜱虫吸血食入后在蜱虫肠内仅在1h内就可以完成配子生殖，形成合子。96h内虫体随血淋巴进入蜱虫的卵内，孵化出幼蜱。幼蜱发育为若蜱，在唾液腺内发育成子孢子。子孢子吸食健康牛马等哺乳动物的血液，导致哺乳动物造成梨形虫感染。

1.2 流行特点梨形虫的生活史决定了其通过终末宿主硬蜱传播。一种是利用蜱卵传播，即通过蜱虫吸食马属动物血液而使梨形虫进入蜱虫体内并在其中生长以及繁殖，待繁殖后期利用蜱卵而传播给蜱虫后代，后代在吸血过程中通过分泌唾液而将梨形虫传递至马属动物体内。另一种为期间传播，即幼蜱或者若蜱在吸食感染马属动物血液后，可迅速成长为若蜱或成蜱，接着通过吸食马属动物血液而传播。在我国，每年的3、4月，马梨形虫病例逐渐增多，待5月份后其流行逐渐停止。目前，国内已查明的梨形虫的主要传播媒介为微小牛蜱，它是马、牛等动物梨形虫并感染的主要宿主蜱。通过梨形虫的生活史可以分析出梨形虫并主要通过宿主蜱下一代传播本病。因此，马梨形虫病的发生与流行频率与微小牛蜱每年的繁殖代数保持一致。马梨形虫病多见于2岁以内的成年马，死亡率地域成年牛。马梨形虫病存在带虫免疫的现象，但带虫免疫效果表现出不稳定、易复发的特征。

2 临床症状

马梨形虫病的潜伏期为14～20d，初期有稽留热症状。体温可升至30～41.8℃。主要症状为高热、黄疸、贫血以及心肺机能障碍。根据其临床症状的不同可以将其划分为心肺型以及胃肠型两种。在发病初期，两种类型病例均表现为体温升高、精神萎靡、食欲不佳、结膜潮红、腹痛难耐、颤抖不止。（1）心肺型病例还会表现为呼吸以及心跳频率加快，而胃肠型还需表现为咽喉肿痛。发病中期，病畜体温超过40℃，出现稽留热现象。心肺型病例心率增快并表现为心律不齐，心跳加快、精神不振、食欲减少，可视粘膜黄染，眼睑部有出血斑点，唇部及舌面存在出血点，尿液颜色为黄棕色，部分公畜阴囊明显肿大。（2）胃肠型病畜在发病中期的主要症状为流涕及流涎，还表现出先便秘后腹泻的症状，其粪便内夹杂有黏液或血液。中期行动上出现摇摆不稳的症状。待发病后期食欲废绝、反应迟钝、卧地不起，病例体温降低，血液日渐稀薄，及时蚊虫叮咬亦出血不住，最终因衰竭而死亡。

3 诊断方法

通过流行特点以及临床症状可进行初诊，利用实验室诊断方法可以确诊。

3.1 病原组织学检测

3.1.1 血液涂片镜检 在马梨形虫病急性感染期，血液涂片镜检是最为可靠的一种确诊方法。此方便操作简便，仅需在被检测动物耳尖部位采集少量血液，待染色后观察其红细胞，即可明确其是否感染有梨形虫。血液涂片镜检方法应用较为广泛。

3.1.2 淋巴结穿刺检查法 马梨形虫病临床有淋巴肿大的表现。淋巴结穿刺检查法主要用于判断涂片内是否存在裂殖体。其具体操作过程如下：（1）选择淋巴肿大部位的皮肤做剪毛、消毒处理；（2）准备10mL注射器及较粗的针头；（3）在被检测动物体表下肿大淋巴结部位穿刺，抽取淋巴组织；（4）拔出针头，将内容物挤出到载玻片上，（5）用内容物制作组织涂片后固定，待染色后放置在显微镜下观察，寻找样本中是否存在柯赫氏蓝体病原体。若涂片内存在裂殖体即可确诊。淋巴结穿刺检查法对检查时机要求较为严格，因此通常用于辅助性检测。该方法多应用于早期马梨形虫病的诊断。

3.2 血清学检测

3.2.1 补体结合试验 该试验是一种传统的血清学检测方法，其敏感性强、特异性高、判断结果明确，应用极为广泛，适用于疫病中后期的检测。补体结合试验不仅可用于检测已感染动物，同时对健康带虫动物敏感性亦较高。

3.2.2 免疫荧光抗体检测 免疫荧光抗体检测方法主要用于诊断外表健康、无明显临床症状的带虫宿主，其敏感性以及特异性较强，检测准确率较高，缺点为操作复杂，荧光抗体所需要的成本较高。

3.3 核酸检测

3.3.1 PCR检测法PCR检测法是采用聚合酶链式反应技术进行病原学检测的方法。PCR通过一对特异性引物对特异性靶基因进行体外DNA扩增的技术。Figueroa于1922年建立了检测双芽巴贝斯虫感染的PCR方法。方式的检测灵敏度达到了10pg虫体基因组的量。Aktas等于2005年通过PCR技术检测野外具尾扇头蜱感染羊泰勒虫的情况，发现在192个受检蜱中感染羊泰勒虫的阳性率为19.27%。Willams和Welsh对PCR技术通过建立DNA随机扩增技术进行改进。他设计2对引物对目的片段进行两次扩增。这次改进提升了PCR技术测定双芽巴贝斯虫的灵敏性。Liu等于2006年建立巢氏PCR技术对国内湖北境内水牛巴贝斯虫的流行病学进行了调查，确定水牛的巴贝斯虫染虫率为10-8时可检测到基因组DNA。Andy Alhassan等于2005年采用18SrRNA建立可同时检测多种梨形虫的PCR方法。该方法也是依据扩增目的条带大小的不同来鉴别梨形虫的感染情况。这种检测方法操作简单快速，测试结果与其他方法相同。Chul K等用Realtime PCR方法对来自加纳和巴西两个地区的马匹进行血液原虫的检测，检出马泰勒虫阳性检出率为100%。刘启生建立的实时荧光PCR检测方法，用快速定性检测巴贝斯虫（Babe-sia bovise、Babesia bigemina）。这两种方法的检测灵敏性更，目前以广泛应用于蜱虫传播的梨形虫病的初期诊断，成为马梨形虫病临床快速检测的重要手段。与传统的血液涂片镜检方法相比，PCR检测法具备更高的敏感性，同时其操作简便快速，应用较为普遍。虽然PCR法可快速鉴定目标病原体，但是这种方法依赖于检测某一部分序列，未足够精准量化整个靶序列，在其具体应用过程中，PCR技术无法很好的量化感染程度。

3.3.2 环介等温扩增技术 环介等温扩增技术是一种新兴快速扩增技术，该技术敏感性较强、操作简便并且快速，已经被广泛应用于疫病检测以及食品安全检测当中，这一检测方法非常适宜开展现场检测。环介等温扩增技术可以对PCR技术存在的部分缺点有效克服，自建立以来即开始在各种核酸DNA检测中得到应用，其在马梨形虫病的检测当中亦发挥了积极的作用。

3.3.3 反向线性印迹技术（RLB）反向线性印迹技术也叫斑点印迹法或点印迹法。它是一种以PCR和针探杂交为基础的分子诊断技术。采用反向线性印迹技术检测马梨形虫病的原理与PCR类型，也是根据设计不同特异性扩增产物与针探杂交来检定梨形虫病病原体。谢俊仁建立的反向线性印迹技术检测马梨形虫病的方法，可同时对多个样本进行检测。样品最多可达45个。同时检测样本的方法提高了马梨形虫病的检出效率，为马梨形虫病的鉴别和快速确诊奠定了基础。在调查马梨形虫的流行病学并对其进行临床试验诊断时，可能会发现部分动物同时感染有多种血液原虫病原，此时即可应用反向线性印迹技术。这一技术主要是在印迹膜上固定特异性探针，采用放射物质标记PCR引物，接着扩靶DNA，待膜上探针与扩增产物特异性杂交后，可通过生物素显影或者放射显影的方式以确定PCR产物内核酸序列差异。反向线性印迹技术的在马梨形虫病检测中的应用优势是结果准确、检出快速，局限在于操作技术难度高、过程复杂，对专业技术人员要求极高，不便于基层推广。

4 综合诊断

4.1 临床诊断根据临床症状结合病死马尸体剖检进行确诊。病死马尸体器官组织体有明显的实质性病变。患梨形虫病的病死马匹有全身明显的实质性器官肿大、出血症状。最为典型的症状是胃黏膜肿胀，出现血斑，有高粱至蚕豆大面积的溃疡发生。病变部位边缘隆起，呈现红色。中间凹，呈灰色。感染严重的马匹病灶溃疡面积超过胃部的50%。其中以泰勒虫病溃疡面积≥50%的症状极为典型。

4.2 特征性诊断根据临床症状结合病死马实体器官组织抹片检查找到石榴体确诊。

4.3 病原学诊断根据临床症状结合血液病原检查虫体的结果确诊。发病后1～2d高热期时可采血进行血液病原学检查。马梨形虫病在临床上没有血红蛋白尿的特征，黏膜黄疸症状也相对不明显。

4.4 限制性内切酶片段长度多态性技术（RFLP）限制性内切酶片段长度多态性技术也是一种建立在PCR基础上的病原学检测基础。该技术也需要通过设计合适的扩增引物，通过扩增片段的限制性内切酶识别。它是目前马梨形虫病临床检测诊断中应用最广泛的技术。其应用优势是敏感性好，可检测多种媒介内的梨形虫病原体感染情况。该方法的实施是在PCR的基础上，对不同的属和种以不同的酶内切后电泳条带的不同加以分别。Gebels等于2000年用该技术对牛巴贝斯虫、牛泰勒虫进行检测。Jefferies等于2007年用该技术来对狗梨形虫进行鉴定。徐宗可用PCR-RFLP技术改进后对羊梨形虫进行鉴定。PCR-RFLP技术的发展为梨形虫病的流行病学调查、致病机理研究及诊断奠定了基础。

PCR-RFLP技术在多类型梨形虫混合感染的鉴定与诊断方面的应用优势较为突出。其局限性在于鉴定操作工作量大。相对于传统的RFLP技术，PCR-RFLP技术在梨形虫临床诊断方面的技术还有待进一步研究。PCR-RFLP技术最为重要的价值在于发现了梨形虫病的新虫种与新基因型。在这方面的研究，可通过与DNA检测技术的综合性研究来实现。