鸭疫里氏杆菌流行株的分离鉴定及耐药性分析

徐 盾

（辽宁省海城市种畜禽监督管理站，辽宁 海城 114200）

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的鸭，鹅、火鸡等多种家禽和野禽的一种接触性、急性或慢性、败血性传染病，主要侵害1～8周龄的小鸭，临床症状特点为眼和鼻有分泌物、绿色腹泻、共济失调和抽搐；慢性病例出现神经症状；病变特征为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎、关节炎及麻痹。本病在易感雏鸭群中的发病率和病死率都很高，常引起小鸭大批死亡以及发育迟缓，是危害养鸭业的主要传染病之一，常常造成严重的经济损失。我站2021年

3～5月间从辽宁省大连市部分养鸭场分离到5株RA，并对其进行细菌血清型鉴定、药敏试验和耐药基因检测分析，旨在为辽宁省大连地区鸭传染性浆膜炎的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源 临床疑似RA感染鸭来源于辽宁省大连市部分养鸭场。

1.1.2 主要试剂及培养基 琼脂糖凝胶回收试剂盒购于Omega公司。药敏纸片、微量生化鉴定管、麦康凯琼脂培养基、TSB、TSA购于杭州微生物试剂有限公司。核酸染料、瑞氏染液和革兰氏染液。头孢噻呋钠、阿莫西林、氨苄西林、林可霉素、红霉素、新霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、大观霉素、氟苯尼考和左旋氧氟沙星等10种药敏片均购自南京建成科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离培养 将病鸭的肝和心脏切碎，在无菌操作台上点燃酒精灯，灼烧接种环灭菌，冷却后，在酒精灯旁将样品接种于巧克力培养基，CO2恒温37℃培养24～48h，进行涂片镜检，同时将挑取单个菌落在含有胰蛋白酵母的肉汤中，37℃48h进行纯培养。

1.2.2 细菌鉴定

1.2.2.1 细菌生化鉴定 将纯培养菌依次接种于细菌生化鉴定管中，参考对照手册观察结果。

1.2.2.2 细菌16S rRNA基因鉴定 在无菌操作台上用2mL纯培养物来提取细菌总DNA。依文献合成细菌16S rRNA基因通用引物（F：ATGGAGCAAGATTTATTCATTATTTGGGATAGATGCCTAC；RTA、TTTCTATTTTCTCTTCAATTCTTTATGTACTTTC，目的条带为1600bp。）用于PCR扩增。操作完毕后将产物经琼脂糖凝胶电泳分离，然后回收目的基因，进行测序。

1.2.2.3 细菌血清型鉴定 将合格菌株放在30%的甘油保菌液中分装保存，送到锦州医科大学畜牧兽医学院动物传染病实验室，将5株RA分离菌用玻片凝集的方法鉴定。

1.2.3 药敏试验 采用Kirby-Bauer纸片法进行药敏试验，判定药敏抑菌结果的标准为：抑菌环直径20mm以上为极度敏感；15～20mm为高度敏感；10～15mm为中度敏感；在10mm以下为低度敏感；不出现抑菌环则为耐药性。

2 结果

2.1 细菌分离培养巧克力培养基中的菌落为直径1～2mm，呈圆形、微隆起、表面光滑、奶油状。

2.2 细菌鉴定

2.2.1 细菌生化鉴定 该菌株不分解葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇；硝酸盐还原、M-R试验、V-P试验、硫化氢产生和尿素分解实验均为阴性，触酶、氧化酶试验为阳性。与鸭疫里氏杆菌的生化特性相符。

2.2.2 细菌16S rRNA基因扩增及序列分析5株菌PCR产物与目的条带大小基本一致。同源性比对的结果显示，同源性达98.7%～99.9%；由此可以判定5株分离菌均为RA。

2.2.3 细菌血清型鉴定 上述分离到5株菌均为血清2型。

2.3 细菌药敏试验对头孢噻呋钠、氟苯尼考、左旋氧氟沙星高度敏感，对阿莫西林、氨苄西林、林可霉素、红霉素、新霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、大观霉素均有不同程度的耐药。

3 讨论

RA血清型众多，世界各地的分离到血清型超过20个，我国的血清型超过15个（即1～15型和其他新型），目前我国流行的优势血清型为血清1型。各血清型之间抗原性差异较多，缺乏交叉保护，导致RA的免疫防治十分具有挑战性。程龙飞等对福建省RA调查发现2型和11型为优势血清型；荆雅玮等研究表明安徽省RA优势血清型为10型；林树乾等研究表明山东省RA优势血清型为1型和2型。本研究表明大连市分离的5株RA都为血清2型，这也进一步证明不同地区RA的优势血清型不同，应因地制宜选择合适的疫苗进行免疫防控。

近年来，在家禽的饲料中大量的添加抗生素，RA菌株对各种抗生素产生了极高的耐药性，从而导致了多重耐药菌株的出现，同时也威胁着人类的健康。朱元军等通过对我国南方部分地区的RA分离菌进行耐药分析，发现菌株对四环素、卡那霉素和红霉素等抗菌药物均有极高耐药性。董洪燕等报道徐州地区RA分离菌对氨基糖苷类（卡那霉素、庆大霉素、新霉素、丁胺卡那霉素）和多肽类（多黏菌素B）耐药性较高；对氟苯尼考，头孢曲松最敏感，本研究表明大连地区RA分离菌对头孢噻呋钠、氟苯尼考、左旋氧氟沙星高度敏感，对阿莫西林、氨苄西林、林可霉素、红霉素、新霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、大观霉素均有不同程度的耐药。也说明不同地区RA分离菌对不同种药物的耐药性有所不同。

4 结论

本试验成功从辽宁省疑似RA感染的发病鸭心脏和肝组织中分离的5株为血清2型，并且5株分离菌对抗菌药物均有极高耐药性，这显示大连市目前主要流行为2型血清型，本试验为本地区RA病的疫苗免疫防控和药物防治提供了参考依据。