番茄白粉病室内苗期抗病性鉴定方法研究及种质资源抗病性评价

李小红，赵 雯，周鹏泽，周雪荣，马雪静，杨雯雯，田飞燕，王晓敏，3，4，5

（1.宁夏大学农学院 银川 750021； 2.澳大利亚联邦科工组织 澳大利亚堪培拉 2600 3.宁夏现代设施园艺工程技术研究中心 银川 750021； 4.宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室 银川 750021；5.宁夏设施园艺（宁夏大学）技术创新中心 银川 750021）

番茄白粉病（Tomoto powdery mildew）是番茄生产中一种危害非常严重的世界性真菌病害，已成为制约番茄绿色生产的主要障碍[1]。该病害在我国最早发生于台湾省，近年来我国辽宁、新疆、河南、台湾等地相继报道了该病害的发生[2-4]。随着宁夏地区番茄产业规模化效益显著、种植面积的不断扩大，在露地和设施栽培中，番茄白粉病危害越来越严重[5]。白粉病主要发生在番茄生长的中、后期，病原菌会通过侵染叶片，导致叶片布满白色病斑，甚至枯萎，使番茄光合作用受到严重影响，对番茄果实的品质和产量有很大影响，可造成番茄产量下降30%～50%，严重时甚至绝产[6-10]。

我国已经报道能够引起番茄白粉病的病原菌主要有蓼白粉菌（Erysiphe polygoniDC）、鞑靼内丝白粉菌（Leveillula taurica）和新番茄粉孢菌（Oidium neolycopersiciL.Kiss），属于子囊菌亚门真菌，专性寄生菌，用培养基无法培养保存[11-13]。保存番茄白粉病病原菌主要有活体保存、叶片生根保存和离体叶片保存等方法，活体保存法保存时间最长为80 d，需要注意隔离保存[14]。已报道对黄瓜白粉菌保存方法[15]最好的是二甲基亚砜保存，保存90 d 后病情指数为32.8%，且该方法能纯化保存病原菌。因此，借鉴黄瓜白粉菌的保存方法对番茄白粉菌的保存方法进行研究，旨在为番茄白粉菌的保存提供最佳的保存条件。

可靠的抗病性鉴定方法是抗病育种的基础。郑坤[14]系统地研究了番茄白粉病苗期抗病性鉴定的苗龄、孢子悬浮液浓度、接种方法，却没有考虑接种后保湿时间这一因素，且保湿时间是孢子萌发的重要因素，所以上述方法不是番茄白粉病抗病性鉴定的最佳方法。笔者拟通过对番茄白粉菌不同保存方法的研究，筛选出最佳的保存方法。采用四因素三水平L9（34）正交试验设计，筛选出最佳的番茄白粉病室内苗期抗病性鉴定方法，通过该方法对30份番茄种质资源进行室内苗期白粉病抗性评价，为有效开展番茄白粉病防治与白粉病抗病育种提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 番茄白粉菌材料：选取宁夏银川地区新番茄粉孢菌，配制成约1×106个·mL-1孢子悬浮液，用刷叶法接种到健康的感病品种Moneymaker（MM）上扩繁，并隔离保存。番茄品种：感病品种MM 用于抗病性鉴定方法研究。番茄种质资源：由宁夏大学农学院蔬菜课题组与宁夏巨丰种苗有限责任公司共同收集的30 份番茄种质资源，用于种质资源抗病性评价。种质资源信息详见表1。

表1 30 份番茄种质资源信息

1.1.2 仪器 奥林巴斯SC180 光学显微镜、血球计数板、5 mL 离心管、150 mL 喷壶、培养皿、载玻片。

1.2 方法

1.2.1 白粉菌保存条件筛选 于2021 年9 月在宁夏大学科技楼705 室采用低温保存法、甘油保存法和二甲基亚砜保存法对番茄白粉病菌进行保存，分别于不同时期（30、60、90 d）测定孢子的萌发率及病情指数，从而筛选出最佳的菌种保存条件。

低温保存法：将干燥的孢子取等量分别装入无菌离心管中，放置到不同温度（4、-20、-80 ℃）下进行菌种保存。甘油保存法：将干燥的孢子装入干燥且无菌的离心管中并加入甘油至孢子完全浸没，将孢子混合液置于-20 ℃放置24 h，再放入-80 ℃低温冰箱中保存。二甲基亚砜保存法：将干燥的孢子装入干燥且无菌离心管中并加入10%蔗糖（φ，后同）+12%甘油+7%二甲基亚砜+8%脱脂牛乳的混合液至孢子完全浸没，将孢子混合液置于不同温度（-20 ℃、-20 ℃放置24 h 后转至-80 ℃、-80 ℃）下进行菌种保存。分别以室温保存和新鲜番茄白粉菌分生孢子的萌发率和病情指数为参照（CK1、CK2），采用水琼脂平板法[16]测定孢子的萌发率，接种后调查发病情况，计算病情指数，从而筛选出最佳的菌种保存条件。萌发率/%=已萌发孢子数/观察孢子数×100，病情指数（DI）=Σ（各级病叶数×各级代表值）/（调査总叶数×最高级代表值）×100[17]。

1.2.2 番茄白粉病室内苗期抗病性鉴定方法正交试验 2021 年10 月在宁夏大学试验农场育苗温室将试验材料MM 播种到98 孔穴盘，待幼苗生长至2 叶1 心，移至育苗钵（18 cm×15 cm×13 cm）继续缓苗，待幼苗长至3、4、5 叶期进行人工接种。采用完全随机试验设计，采用四因素三水平L9（34）的正交试验设计对番茄苗龄（A）、孢子悬浮液浓度（B）、接种方法（C）及保湿时间（D）4 个因素，进一步优化番茄白粉病室内苗期抗病性鉴定方法。每个处理3次重复，每次重复种3 株番茄，试验小区面积为6.2 m2，株距为18 cm，行距为38 cm。设计因素与水平详见（表2、表3）。

表2 番茄白粉病室内苗期抗病性鉴定试验因素与水平

表3 番茄白粉病室内苗期抗病性鉴定试验正交设计

接种后观察发病情况，25 d 后病害充分发生并稳定，调查发病率和病情指数：发病率/%=发病叶片数/调查总叶片数×100，病情指数（DI）=Σ（各级病叶数×各级代表值）/（调査总叶数×最高级代表值）×100[18]。分级标准参照郑坤[14]的报道，具体如下：0级，不发病；1 级，叶片有粉斑，茎秆、叶柄无病斑；2级，叶片有粉斑，叶柄病斑≤5%，茎秆上无病斑；3级，叶片有粉斑，5%＜叶柄病斑≤30%，茎秆上无病斑；4 级，叶片有粉斑，叶柄病斑大于30%，茎秆上有病斑。

1.2.3 番茄种质资源室内苗期白粉病抗病性评价 选用1.2.2 中最优的抗病性鉴定方法，在2021年12 月对30 份番茄种质资源进行了抗病性鉴定分析，采用完全随机试验设计，25 d 后调查发病率及病情指数。

抗病性划分标准如下[13]：免疫（I），病情指数为0；抗病（R），病情指数在20.00 以下；中抗（MR），病情指数在20.01～40.00；感病（S），病情指数在40.01～60.00；极感病（ES），病情指数在60.00 以上。

1.3 数据处理

采用Excel 2010 进行数据整理，采用SPSS 20软件对试验数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 番茄白粉病病原菌保存方法研究

由表4 可见，处理1 在30 d 时的病情指数与处理2 无显著差异，与其他处理的孢子萌发率和病情指数均存在显著差异。处理1 在60 d 时孢子萌发率和病情指数与其他8 个处理均有显著差异，处理1 在90 d 时与处理6 无显著差异，与其他7 个处理均有显著差异。处理1 低温保存法，保存条件4 ℃，在30 d 时，孢子萌发率和病情指数分别为44.20%和22.50；60 d 时，孢子萌发率和病情指数为39.60%和22.00；90 d 时，孢子萌发率和病情指数为27.50%和16.30。处理1 在对应的时间内，孢子的萌发率和病情指数均高于除CK2 外的其他7 个处理。表明低温保存法保存温度为4 ℃是番茄白粉菌的最佳保存条件。

表4 番茄白粉菌不同保存方法研究

2.2 番茄白粉病室内苗期抗病性鉴定方法筛选

由表5 可以看出，在不同接种方法处理25 d 后对番茄白粉病的发病率和病情指数进行调查，处理5 仅与处理9 无显著差异，与其他7 个处理均存在显著差异。处理5 的发病率为76.45%，病情指数为46.06，均高于其他8 个处理。因此，处理5 为最佳的番茄白粉病室内苗期抗病性鉴定方法，即接种苗龄为4 叶期、接种浓度为106个·mL-1、刷叶法、保湿时间为24 h。

表5 番茄白粉病室内苗期抗病性鉴定方法研究结果

2.3 30 份番茄种质资源室内苗期白粉病抗病性评价

30 份种质资源白粉病抗病性评价结果见表6，30 份材料中，62850-1 病情指数最低，为19.85，为抗病材料；62754-1 病情指数最高，为62.11，是极感病材料；中抗材料有15 份，为62767-1、D6220G-1、62579- 1、62756- 1、62755- 1、62613- 1、62612- 1、62890- 1、62828- 1、62569- 1、63187- 1、63102- 1、63191-1、63022-1、63014-1；感病材料有13 份，为62615- 1、62640- 1、62865- 1、62758- 1、62765- 1、62764- 1、62763- 1、62760- 1、61972- 7- 1- 3- 16、62736-1、62749-1、62752-1、63052-1。

表6 30 份番茄种质资源抗白粉病评价结果

3 讨论与结论

番茄白粉菌属于子囊亚门真菌，用培养基无法培养保存，不论是无性阶段的分生孢子还是菌丝体，均无法在脱离活体寄主后长期保持活力，而病原菌的长期保存有利于对抗病、致病机制研究，加快抗病育种进程[19-21]。笔者通过借鉴小麦白粉菌和黄瓜白粉菌的保存方法[15,22-24]，对比低温保存法、甘油保存法和二甲基亚砜保存法与不同保存条件及2个对照共9 个处理后测定孢子萌发率和病情指数，筛选番茄白粉菌最适宜的保存方法。笔者的研究结果明确了番茄白粉菌最适宜保存方法是低温保存法（4 ℃），保存90 d 后检测孢子的萌发率和病情指数，除低于对照新鲜孢子外，均高于其他保存方法。郑坤[14]采用活体植株保存法、叶片生根保存法和离体叶片保存法3 种方法均可保存，其中活体植株保存法可保存时间最长达80 d，但受寄主植株生育期限制，需要隔离保存，较为麻烦。吴明藻等[22]和李中存等[23]对小麦白粉菌分别采用试管小苗培养保存、四圃纯化白粉病保存，保存简单方便、时间长、不易污染，缺点是保存菌量较少、不能为抗病育种提供足够的病原菌。康萍芝等[15]研究黄瓜白粉病菌适宜的保存方法为10%蔗糖+12%甘油+7%二甲基亚砜+8%脱脂牛乳混合液保存法，在-20 ℃冰箱中保存效果较好，优点在于脱离活体寄主进行保存。但笔者的研究表明，该方法对番茄白粉菌的保存效果较差，没有低温保存法（4 ℃）效果好，这可能与白粉菌不同种属、不同生理小种本身特性有关，需要对白粉菌的特性进行进一步研究。后续也可以在4 ℃保存的基础上增加其他因素来研究白粉菌的保存时间是否更长。

高效的抗病鉴定技术是筛选抗病种质资源的重要手段。抗病性鉴定方法与试验材料抗性、苗龄、接种方法、保湿时间等因素互相作用有关[24]。李成伟等[25]将孢子悬浮液浓度调至2×104个·mL-1，在番茄苗龄为4～5 片真叶时进行喷雾接种。王联德等[26]采用叶片摩擦法将孢子接种到4 叶期的感病番茄第一生长叶片上，他们对接种方法没有研究。郑坤[14]以东农714 为材料，通过正交试验，对番茄白粉病苗期的抗病性鉴定方法进行了初步探讨，结果表明，接种方法为喷雾法、接种苗龄为4 叶期和接种孢子悬浮液浓度为106个·mL-1是最佳组合。笔者的研究结果表明，刷叶法和喷雾法均可作为番茄苗期室内抗病性鉴定方法，其中刷叶法所需苗龄较小，孢子浓度低，可提前接种，喷雾法所需苗龄较刷叶法大，用菌量较大。与郑坤[14]不同的主要原因有两方面，一是用于抗病性鉴定的材料不同；二是增加了保湿时间这一因素，综合考虑了苗龄、孢子浓度、接种方法及保湿时间4 个因素之间交互作用，更加系统全面地研究了番茄苗期白粉病抗病性鉴定方法。从30 份番茄种质资源中筛选出1 份抗病材料和1 份易感材料，15 份中抗材料，13 份感病材料。抗病材料和感病材料可分别用于番茄白粉病的抗病机制和致病机制研究，抗病材料也可用于抗病育种，但抗病材料太少。因此当前最紧迫的工作是广泛地从国内外番茄种质中心及野生种质中收集抗源，为白粉病抗病品系选育提供材料。

笔者的研究结果明确了4 ℃是最佳的白粉菌保 存 条 件；4 叶 期，孢 子 浓 度 为1×106个·mL-1，采用刷叶法，保湿24 h 是最佳的番茄白粉病室内苗期抗病性鉴定条件；最抗病番茄材料为62850-1。