黄芩苷联用对乙酰氨基酚的协同镇痛作用

白庆云， 田锦鸿， 曹春蓉， 许斌衡， 胡 甜， 王春宝

(宜春学院化学与生物工程学院，江西 宜春 336000)

疼痛是多种疾病的伴随症状，是一直困扰人类健康的严重问题[1]。如何有效缓解疼痛，减轻其对人们生理和心理引起的损害，是长久以来备受关注的研究热点[2]。由于疼痛的发生机制颇为复杂，涉及多个环节，使用单个药物往往难以达到理想的镇痛效果，所以联合用药越来越多地被应用于疼痛的治疗[3]。通过将机制不同的2种或2种以上镇痛药物联合使用，不但镇痛效果可以相加或者协同增效，还能使药物用量减少，毒副作用降低，从而获得更好的治疗效果[4-6]。

对乙酰氨基酚属于非甾体类抗炎药，是常用的解热镇痛药，用于缓解轻、中度疼痛，但其镇痛作用不强，且具有明显的消化系统不良反应[7]，过量使用会引起严重的肝损伤甚至肝功能衰竭[8]。黄芩苷是黄芩中提取的黄酮类成分，具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态、解痉、镇痛、抗炎、保肝等作用[9]。关于黄芩苷和对乙酰氨基酚联合使用治疗疼痛的研究尚未见报道。本实验通过建立小鼠醋酸扭体疼痛模型，采用扭体次数、等辐射分析法对黄芩苷和对乙酰氨基酚联合应用的镇痛作用进行分析，并对其机制进行初步探索。

1 材料

1.1 动物 SPF级雌性ICR小鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2016-0002，体质量18～22 g，适应环境3 d，室温20～24 ℃，标准饲料喂饲，自由饮水。

1.2 试剂与药物 对乙酰氨基酚(纯度≥99.0%，上海麦克林生化科技有限公司，货号103-90-2)；黄芩苷(纯度≥98%，上海英索生物科技中心，货号B20570)。CMC-Na、醋酸(上海麦克林生化科技有限公司，货号C804628、E801077)；PGE2试剂盒(上海研谨生物科技有限公司，货号F00512)；LTA4、NF-κB试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，货号CEA497Ge、SEB824 Mu)；TNF-α试剂盒(上海联科生物科技有限公司，货号EK282HS-48)。

1.3 仪器 M200型酶标仪(瑞士Tecan公司)；DHP-9082型恒温孵育箱(上海一恒科学仪器有限公司)；QB-9001型微孔板振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

2 方法

2.1 造模 0.6%醋酸溶液腹腔注射建立疼痛模型，剂量为10 mL/kg，记录造模后20 min内小鼠扭体次数(小鼠产生腹部内凹、躯体扭曲和后肢伸张等行为反应)，作为疼痛评价指标，计算疼痛抑制率，公式为疼痛抑制率=(对照组扭体次数-实验组扭体次数)/对照组扭体次数×100%。

2.2 分组与给药 将造模成功后的小鼠分为对照组(10只)、黄芩苷组(50只)、对乙酰氨基酚组(50只)、联合用药组(40只)。对照组小鼠灌胃给予生理盐水和0.1% CMC-Na溶液；黄芩苷组小鼠分别灌胃给予15、22.5、33.8、50.6、75.9 mg/kg黄芩苷；对乙酰氨基酚组小鼠分别灌胃给予40、60、90、135、202.5 mg/kg对乙酰氨基酚；联合用药组小鼠按黄芩和苷对乙酰氨基酚ED50剂量的50%、25%、12.5%、6.25%分别灌胃给药，灌胃容量为10 mL/kg。给药后30 min，按“2.1”项下方法造模，记录扭体次数。

2.3 ELISA法检测小鼠血清PGE2、LTA4、TNF-α、NF-κB和脑组织PGE2、LTA4水平 40只小鼠随机分为对照组、黄芩苷组(39.67 mg/kg)、对乙酰氨基酚组(90.81 mg/kg)、联合用药组(19.84 mg/kg黄芩苷+45.41 mg/kg对乙酰氨基酚)，给药后30 min，按“2.1”项下方法造模，10 min后取血和脑组织。血液冰上静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，取上清备用；脑组织加入5倍量0.1 mol/L预冷PBS，用匀浆机研磨，将匀浆液12 000 r/min离心10 min，取上清备用。按ELISA试剂盒说明书加入各反应液，反应完成后，于酶标仪在450 nm波长处检测光密度(OD)值，计算小鼠血清PGE2、LTA4、TNF-α、NF-κB和脑组织PGE2、LTA4水平。

3 结果

3.1 对乙酰氨基酚对小鼠扭体次数的影响 与对照组比较，对乙酰氨基酚各剂量组小鼠扭体次数减少(P<0.01)，且随着剂量的增加，扭体次数减少，疼痛抑制率升高，见表1。对乙酰氨基酚的ED50为90.81 mg/kg，95%可信限为80.84～145.35 mg/kg。

表1 对乙酰氨基酚对小鼠扭体次数的影响

3.2 黄芩苷对小鼠扭体次数的影响 与对照组比较，黄芩苷各剂量组小鼠扭体次数减少(P<0.01)，且随着剂量的增加，扭体次数减少，疼痛抑制率升高，见表2。黄芩苷ED50为39.67 mg/kg，95%可信限为30.02～52.30 mg/kg。

表2 黄芩苷对小鼠扭体次数的影响

3.3 黄芩苷联合对乙酰氨基酚对小鼠扭体次数的影响 与对照组比较，联合用药各剂量组小鼠扭体次数减少(P<0.01)，在1/2～1/16 ED50剂量范围内，随着剂量的增加，扭体次数减少，疼痛抑制率升高,见表3。两药联用的ED50为黄芩苷10.65 mg/kg、对乙酰氨基酚29.18 mg/kg，95%可信限为9.90～12.40、27.01～33.85 mg/kg。

表3 黄芩苷联合对乙酰氨基酚对小鼠扭体次数的影响

3.4 黄芩苷与对乙酰氨基酚的相互作用 等辐射分析法是一种准确定量分析药物之间相互作用的方法[10]，在等辐射图中，将2种药物单独使用时的强度(用ED50表示)分别标绘在X轴、Y轴上，两点相连形成相加线，如果药物联用后强度落在此相加线左侧，则表示两药为协同作用；如果落在该线上，则代表两药为相加作用；如果落于右侧，则两药为拮抗作用。由图1可知，坐标轴上A、C两点分别为黄芩苷和对乙酰氨基酚单用时的ED50，A、C两点相连即为相加线，D点为两者理论上相加的ED50，B点为两者联用的实测ED50。B、D两点的ED50比较差异显著，具有统计学意义(P<0.05)；由于B点落在相加线左侧，因此可以判定黄芩苷和乙酰氨基酚在镇痛效果上呈现协同作用。

3.5 黄芩苷联合对乙酰氨基酚对小鼠脑组织和血清PGE2、LTA4水平的影响 与对照组比较，各用药组小鼠脑组织和血清中PGE2水平降低(P<0.05)，其中联合用药组作用更显著(P<0.05)；黄芩苷组和联合用药组小鼠脑组织和血清中LTA4水平降低(P<0.05)，对乙酰氨基酚组无明显变化(P>0.05)，见图2。

3.6 黄芩苷联合对乙酰氨基酚对小鼠血清TNF-α、NF-κB水平的影响 与对照组比较，各用药组小鼠血清TNF-α、NF-κB水平降低(P<0.05)，其中联合用药组作用更显著(P<0.05)，见图3。

4 讨论

对乙酰氨基酚属于非成瘾性镇痛药，在临床上应用较为广泛，常用于治疗感冒发烧、肌肉酸痛，关节疼痛，痛经，术后疼痛、癌症疼痛等[11-12]。对乙酰氨基酚在40～202.5 mg/kg范围内，随着剂量的增加，扭体次数减少，抑制率升高，说明对乙酰氨基酚具有镇痛作用。黄芩苷作为黄芩的主要活性成分，已被研究证明其可以减轻实验性关节炎的炎症反应和疼痛[13]，对神经痛[14]、偏头痛[15]和牙齿术后疼痛[16]也有镇痛效果。黄芩苷在15～79.5 mg/kg范围内，随着剂量的增加，扭体次数减少，抑制率升高，证明黄芩苷具有镇痛作用。

对乙酰氨基酚是多种复方药物的组成成分，在使用时极有可能因剂量叠加而过量[17]，导致胃肠道反应的发生和肝肾损害[18]。寻找具有不同作用机制的镇痛药物与之联用可以增强其镇痛疗效，降低用量，从而减少或者避免不良反应发生[19-20]。本研究显示，对乙酰氨基酚和黄芩苷联用，在一定剂量范围内，随着联用剂量的增加，小鼠扭体次数减少，抑制率升高。两药联用的实测ED50小于两药单用的理论ED50(P<0.05)，通过等辐射分析可以判断，两药联用是协同增效的作用关系。

对乙酰氨基酚镇痛的主要机制是减少PGE2的产生，PGE2是花生四烯酸经环氧合酶途径(COX)生成的代谢产物，是一种重要的致炎致痛物质[21]。对乙酰氨基酚可同时抑制中枢和外周的COX2，减少PGE2的产生，发挥抗炎镇痛作用[22]。研究发现，黄芩苷的抗炎镇痛机制可能与抑制COX2酶活性，减少PGE2的产生有关[23]。本研究结果显示，单用对乙酰氨基酚或黄芩苷均能降低小鼠脑组织和血清PGE2水平，而联合用药组降低PGE2水平作用更佳，说明两者联用协同镇痛的机制之一是抑制中枢和外周的PGE2产生。LTA是花生四烯酸经脂氧酶途径代谢的产物，LTB4是由LTA4水解酶生成的，两者都是重要的致炎致痛物质。研究表明，黄芩苷能调节花生四烯酸的代谢，从而减少其下游代谢产物LTA和LTB的水平，减轻过敏性鼻炎的炎症反应[24]。本研究结果显示，黄芩苷能降低小鼠脑组织和血清LTA4水平，而对乙酰氨基酚对小鼠脑组织和血清LTA4水平无明显影响，联合用药组小鼠脑组织和血清LTA4水平也降低。由此可知，在中枢和外周，黄芩苷既能抑制花生四烯酸环氧酶代谢途径，又能抑制脂氧酶代谢途径，从而降低PGE2和LTA4水平，而对乙酰氨基酚只降低环氧酶途径的代谢产物PGE2水平，两者联用可降低LTA4水平，并使PGE2水平进一步降低。

NF-κB是诱导性转录因子家族，可被TNF、白介素等激活，进而调节与炎症、细胞存活、增殖和分化相关基因的快速转录[25]。研究表明，黄芩苷可以抑制溃疡性结肠炎大鼠NF-κB信号通路[26]；对乙酰氨基酚可以降低IL-1β诱导的人类星形胶质细胞系中的NF-κB核易位[27]。本研究结果显示，单用黄芩苷或对乙酰氨基酚均可降低血清NF-κB、TNF-α水平，两者联用后NF-κB和TNF-α水平更低，说明黄芩苷和对乙酰氨基酚联用协同镇痛的机制与抑制NF-κB信号通路有关。

综上所述，黄芩苷联合对乙酰氨基酚对急性炎性疼痛具有协同镇痛作用，且联用后两者用量均减少，可有效减少对乙酰氨基酚的不良反应，其协同镇痛机制可能与减少花生四烯酸的代谢产物和抑制NF-κB信号通路有关，但其更全面的作用机制尚待进一步研究。