人角膜基质细胞的表型研究进展

杨怡 综述 牛阳 袁玲 审校

1宁夏医科大学基础医学院，银川 750004；2宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，银川 750004；3宁夏医科大学药学院，银川 750004

人角膜基质细胞(human corneal stromal cells，HCSCs)是正常角膜基质层中的主要细胞成分，存在于平行排列的胶原纤维之间，通过细胞突起顶部的间隙进行相邻细胞间物质信息传递[1]；其具有合成和分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分，如胶原蛋白、糖胺聚糖、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)以及受到刺激后向角膜细胞修复表型转化的功能，在维持角膜结构完整性和创伤修复中发挥重要作用[2]。

人角膜基质创伤愈合是一个非常复杂的过程，当角膜基质层受到创伤、感染或手术后，处于静息状态的HCSCs被刺激，转变为激活状态的人角膜基质细胞(human corneal keratocytes，HCK)，继而发生死亡或转化为修复表型，引起角膜基质混浊，角膜深层出现新生血管、持续性炎症反应、纤维化甚至是不同程度的角膜瘢痕，导致畏光和视力下降等临床症状[3]。感染性角膜溃疡、免疫紊乱(如圆锥角膜等)以及目前临床应用激光矫正视力角膜手术(如准分子激光手术、激光光学角膜切削术等)均能引起角膜基质混浊和瘢痕[4]。同时HCSCs的结构和功能发生变化可导致角膜的透明度降低，使视力受到损害。因此，深入研究HCSCs表型的转化过程以及其调控机制，不仅有助于了解角膜损伤修复的发展过程，而且对于发现、预防和治疗角膜基质纤维化、减少瘢痕形成，甚至逆转瘢痕损伤程度，具有重要的临床意义。本文就HCSCs表型、标志物、表型的转化及其体外转化机制进行综述，以期为发现新的临床治疗手段提供思路。

1 HCSCs表型

1.1 HCSCs

HCSCs是位于角膜的纤维母细胞，是一种正常角膜细胞表型，其能合成并沉积胶原蛋白和硫酸角质素蛋白聚糖(keratan-sulfate proteoglycans，KSPG)等成分，调节基质组织，有助于提高角膜的机械强度和光学清晰度。正常状态下，HCSCs在细胞周期的G0期处于静息状态，呈扁平、树突状，随着哺乳动物胚胎的发育，HCSCs合成并分泌I型胶原蛋白(collagenⅠ，Col Ⅰ)、Col Ⅲ、Col Ⅴ和Col Ⅵ等ECM成分，其中Col Ⅰ最为丰富，Col Ⅴ是胶原纤维组装的重要调控因子[5]。HCSCs所分泌的硫酸角质素、硫酸软骨素等蛋白多糖及晶状体蛋白等(例如乙醛脱氢酶)具有减少角膜细胞光散射的作用，其中晶状体蛋白也可以降低视轴中其他眼部细胞(如晶状体上皮细胞)的光散射[6-7]，同时HCSCs能够合成和降解胶原分子，还能产生MMP，在ECM重构、细胞基质相互作用、炎症细胞募集和细胞因子激活等维持基质稳态方面中发挥至关重要的作用[8]。

1.2 人角膜成纤维细胞

人角膜成纤维细胞由激活状态的HCK转化而来，转化发生在伤口边缘的脱细胞区。人角膜成纤维细胞呈梭形或纺锤形，胞体细长并具有多个核仁，与成纤维细胞相似，因而被称为角膜成纤维细胞[9]。在角膜受到创伤、手术或感染刺激时，HCK迅速发生凋亡，并转化为角膜成纤维细胞和肌成纤维细胞，这些修复表型的细胞参与纤维性创伤愈合反应，通过改变环境条件调节基因表达、收缩性和基质蛋白的产生等[10]，促进角膜再生或诱导产生纤维化瘢痕，有助于创伤修复。同时，有研究发现瘢痕和角膜营养不良等类型的角膜混浊主要是由活化后的HCK光散射增加引起的[11]。

人角膜成纤维细胞在角膜基质损伤修复过程中不断合成各种ECM成分和蛋白酶，重塑基质层，在维持角膜透明度和机械稳定性方面起着重要的作用[12]。在细菌侵入角膜基质层诱发白细胞浸润和溃疡时，角膜成纤维细胞在炎症因子的刺激下产生多种化学物质和黏附因子，从而促进角膜损伤的修复，在角膜的防御系统及角膜的创伤愈合过程中起至关重要的作用[13]。

1.3 人角膜肌成纤维细胞

人角膜肌成纤维细胞可由人角膜成纤维细胞转化，是角膜手术、损伤和感染后在角膜基质中观察到的另一种修复表型，也是成纤维细胞被激活后的一个具有较大外形的细胞亚群。在正常未受伤的角膜中未检测到肌成纤维细胞[14]。人角膜肌成纤维细胞是具有平滑肌细胞超微结构和生理特性的成纤维细胞，具有收缩伤口、分泌ECM并与周围基底产生黏附结构的能力。因此，人角膜肌成纤维细胞可能在创伤性角膜撕裂后恢复眼部完整性的过程中发挥重要作用。

2 HCSCs表型的标志物

2.1 HCSCs标志物

HCSCs是一种来源于神经嵴的间充质细胞，其典型特征是存在某些细胞表面标志物和中间纤维。CD34和CD133是体内静息状态HCSCs的典型标志物，在角膜创伤后，CD34表达迅速消失，HCSCs被激活，伤口附近的HCK分化为成纤维细胞表型[15-16]。研究发现HCK在标准组织培养条件下，角蛋白、核心蛋白聚糖等富含亮氨酸的小蛋白多糖以及乙醛脱氢酶1A1(acetaldehyde dehydrogenase 1A1，ALDH1A1)和ALDH3A1亚型等角膜晶状体蛋白的表达迅速消失[7，10]，同时产生的细胞也失去HCK特有的树突状结构，具有了成纤维细胞的特性[17-20]。

2.2 人角膜成纤维细胞标志物

角膜创伤导致与伤口相邻的HCK向成纤维细胞转化，产生高表达的纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、整合素α5β1、MMP-1、MMP-3和MMP-9，并分泌胶原蛋白和蛋白多糖[21]。研究还发现在培养的人角膜成纤维细胞中可以检测到CD90 mRNA和蛋白，但在新鲜分离的HCK中未检测到，因此认为CD90的表达是由HCK转化为角膜成纤维细胞和肌成纤维细胞引起的[22]。角膜成纤维细胞也是基质混浊、角膜晶状体蛋白减少和ECM表达改变的来源[23]。

2.3 人角膜肌成纤维细胞标志物

肌成纤维细胞特定生化标志物是α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，该肌动蛋白是肌成纤维细胞特征性表达的细胞骨架蛋白，也具有增强角膜组织收缩的功能，在组织纤维化、伤口愈合及瘢痕形成中起着重要作用[24-25]。有研究表明角膜肌成纤维细胞最早的基质前体表达波形蛋白，不表达α-SMA或结蛋白，α-SMA是细胞发育成熟的后期标志物[26]。也有研究发现，角膜创伤愈合后形成的瘢痕中含有大量的纤维粘连蛋白EDA片段和Col Ⅲ，而在角膜发育过程中几乎看不到这2种蛋白，认为这2种蛋白可作为纤维化标志物[5]。与α-SMA和Col Ⅲ一样，血小板反应蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)在健康人的HCSCs中不表达，在损伤后的细胞中有表达[27]。TSP-1是在伤口愈合过程中转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的重要激活因子[28]。

Nishtala等[31]利用定量蛋白质组学分析发现，与HCK相比，角膜成纤维细胞和肌成纤维细胞中的整合素信号传导、SLIT-ROBO通路(PFN1、CAPR1、PSMA5)以及ECM蛋白(SERPINH1、SPARC、ITGβ1、CRTAP)表达增强，表明其在伤口愈合过程中发挥作用。

3 HCSCs表型的转化

3.1 体内转化过程

当角膜受到严重创伤、手术或感染后，损伤区域周围的HCK通过凋亡来防止修复过程引起的对组织结构不利的变化。损伤约6 h后，相邻的静息状态HCSCs被激活，细胞大小和细胞器含量均增加，并在24 h内向损伤处迁移，开始从HCK向成纤维细胞转化。该转化过程由成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)和血小板衍生生长因子BB、TGF-β等生长因子介导[32-33]，与细胞FN和机械张力共同调节白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，从而促进细胞有丝分裂。转化后的角膜成纤维细胞进入细胞增生期并向损伤部位迁移，同时细胞形态和功能均发生改变，能够识别、清除死亡细胞[10]。创伤后48 h细胞抵达损伤处，表现出成纤维细胞的典型形态学特征，包括梭形、多核仁和缺乏胞质颗粒[34]。这些成纤维细胞通过肌动蛋白细胞骨架重塑，从星状变为细长状并获得应力[35]。TGF-β调节静息状态HCSCs转化为成纤维细胞，上调ECM物质分泌，并在细胞迁移至创面后诱导肌成纤维细胞标志物α-SMA、结蛋白和波形蛋白的表达并向肌成纤维细胞转化[34]。

在角膜损伤后1～2周，具有收缩特性的肌成纤维细胞进入损伤区并参与基质重建，控制创面收缩以及异常ECM沉积，是导致基质瘢痕/纤维化和混浊的主要病理过程[36-37]。当组织修复达到一定程度时，成纤维细胞发生凋亡，数量缓慢减少，肌成纤维细胞开始侵袭并充满创伤处，最终形成成熟的瘢痕[38]。经过数月或数年的修复，上皮基底膜完全再生，规则的角膜ECM逐渐取代肌成纤维细胞及其产生的混浊基质，该过程中肌成纤维细胞与基质细胞相互竞争，异常的ECM被重吸收，角膜细胞重新组成前基质，角膜透明度逐渐恢复[37]。

角膜瘢痕的形成导致角膜透明度降低并损害视力，因此，研究角膜伤口愈合过程，探讨预防纤维化和新生血管并发症发生的机制和方法具有重要的临床意义。有研究表明，活化的角膜成纤维细胞和肌成纤维细胞不是终末分化表型，而是可以彼此相互转化的[39]。利用这一点可以针对HCSCs被激活后的表型转化进行体外研究，以预防瘢痕对角膜透明度及视力的影响。

3.2 体外转化过程

3.2.1HCK转化为成纤维细胞和肌成纤维细胞 当在体外无血清培养基中培养时，HCK会保持树突状，通过添加血清、TGF-β或某些生长因子可诱导其向成纤维细胞和肌成纤维细胞转化。Sharma等[40]将人角膜基质切成小块置于培养皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM杜氏改良Eagle培养基中并在37 ℃、5%CO2湿化培养箱中培养2周或以上，得到角膜成纤维细胞，然后置于含10%胎牛血清的DMEM中培养，在其融合度达到60%～70%后改用含10%血清的DMEM培养，在8～12 h后换至含有TGF-β1(1 ng/ml)的无血清培养基中培养4～7 d，每24 h更换新鲜不含血清的TGF-β1培养基，成功得到肌成纤维细胞。

在体外细胞培养过程中发现，添加血小板衍生生长因子BB后，细胞聚集并形成细长梭形的成纤维细胞表型[41]。FGF-2具有促进细胞分化、增生、维持成纤维细胞表型的作用，而碱性成纤维细胞生长因子可通过增加细胞增生来抑制肌成纤维细胞分化，从而加速伤口闭合[9]。Soniecka 等[29]研究发现在培养基中加入维生素C和TGF-β1可以诱导角膜成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。

角膜瘢痕形成的关键是TGF-β诱导HCK分化为成纤维细胞和肌成纤维细胞，抑制该分化过程可能对角膜瘢痕形成具有抑制作用。诱导HCK纤维化的关键因子TGF-β有3个亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β1是角膜创伤愈合过程中释放的主要亚型，与TGF-β2共同诱导纤连蛋白的合成以及黏着斑的聚集、诱导细胞迁移、瘢痕收缩和ECM沉积[42]；TGF-β1还可促进α-SMA的表达，在角膜瘢痕形成中起至关重要的作用。与TGF-β1相似，TGF-β3也可促进肌成纤维细胞的分化，诱导细胞Col Ⅲ和α-SMA表达增加[41，43]。但也有研究表明TGF-β3能够刺激角膜成纤维细胞分泌大量ECM，可以逆转纤维化标志物Col Ⅲ的表达，具有抗纤维化特性，推测IL-10和TGF-β3是治疗角膜修复和预防纤维化的潜在靶点[26-27]。

3.2.2成纤维细胞和肌成纤维细胞转化为HCK 针对角膜创伤后愈合过程中纤维化表型对角膜透明度的影响，亟需探索逆转纤维化的方法。体外细胞研究发现，在无血清基础培养基中加入抗坏血酸、视黄酸、胰岛素转铁蛋白硒、IGF-1和3-异丁基-1甲基黄嘌呤可部分恢复静息状态的HCSCs的树突形态，增加HCK标志物ALDH3A1和CD34的表达，阻止HCK向肌成纤维细胞分化，可恢复部分细胞为HCK表型[41]。Miyagi等[44]将人角膜成纤维细胞培养在含有TGF-β1和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)的培养基中，发现α-SMA mRNA表达量与TGF-β1浓度表现出明显的剂量依赖性，并证明了HGF可以抑制TGF-β1诱导的肌成纤维细胞表型分化过程，结果显示HGF通过减少角膜纤维化来改善伤口愈合。

目前大多数针对角膜纤维化的研究仅能抑制该过程。Park等[45]发现胰岛素样生长因子结合蛋白2可以抑制TGF-β1诱导的角膜成纤维细胞中α-SMA表达上调，增加细胞中角蛋白和ALDH1A1的表达，具有维持HCK表型、抑制其向肌成纤维细胞转化的作用。研究发现将含10%胎牛血清的DMEM/Ham培养基培养的原代HCK置于不同浓度光敏剂Ce6下，670 nm光照13 min，HCK向肌成纤维细胞转化在短期内似乎被抑制，但对CD34阳性的HCK激活没有影响[46]。Mohan等[47]研究发现核心蛋白聚糖基因转移可有效抑制TGF-β诱导的HCK转化和成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。胰岛素样生长因子2受体蛋白(insulin-like growth factor 2 receptor，IGF2R)可调节人角膜成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，抑制IGF2R的合成可减少成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，并可用于控制角膜纤维化[48]。有研究发现乙酰胆碱也可以在体外人角膜纤维化模型中抑制角膜成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，表现出抗纤维化作用[29]。Angunawela等[49]对比研究了添加TGF-β1和6-磷酸甘露糖(mannose-6-phosphate，M6P)的含血清培养基与仅添加TGF-β1的含血清培养基中培养的HCK，发现M6P可抑制TGF-β1介导的人角膜成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。体外研究显示，富含生长因子的血浆(plasma rich in growth factor，PRGF)对TGF-β1诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化具有逆转作用，可降低与成纤维细胞分化相关的所有细胞骨架蛋白的表达，表明PRGF可能促进角膜伤口愈合再生并抑制瘢痕的形成[50-51]。

在体外模型中，将聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)-DNA纳米颗粒介导可溶性TGF-β2受体的胞外区基因导入人角膜成纤维细胞中可抑制肌成纤维细胞转化[40]。Nicholas等[26]使用建立的人角膜成纤维细胞3D体外模型，发现鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)的外源性刺激可使α-SMA表达下调，并抑制了角膜成纤维细胞的迁移，提示S1P可能具有抗角膜纤维化能力。近年来，雷帕霉素被发现具有抗纤维化和抗新生血管的作用，对碱损伤也具有保护作用，并可抑制碱损伤后成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化过程[52]。

4 HCSCs的体外转化机制

角膜创伤愈合后的瘢痕形成和透明度降低是影响视力的关键因素，深入了解该过程中涉及的生长因子、细胞因子和信号传导中间体，寻找有效干预角膜愈合中瘢痕形成的方法，可为临床防治角膜创伤愈合过程所带来不利影响提供理论指导。

4.1 PI3K/Akt-1和RhoA/ROCK信号通路

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)与细胞表面的EGF受体结合，激活酪氨酸激酶，并生成ECM分子，可促进细胞增生。研究发现EGF通过激活EGF受体和PI3K/Akt-1信号通路，协同TGF-β1诱导HCK向肌成纤维细胞分化和增生，增加FN的分泌，使ECM成分发生变化[53]。

分布于神经纤维内的一种神经肽P物质(SP)参与角膜创伤的愈合过程，Soniecka 等[54]研究利用体外培养的人角膜纤维化模型发现SP具有诱导角膜细胞收缩，上调Col Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Lumican基因表达的作用，可以促进纤维化标志物α-SMA和FN的分泌和表达，并发现SP可通过激活PI3K/Rac1/RhoA通路和IL-8增强角膜细胞迁移，激活RhoA/ROCK通路诱导HCK发生纤维化改变，从而促进角膜创面愈合。

4.2 TGF-β/Smad信号通路

TGF-β是角膜瘢痕形成过程中的关键因子，由TGF-β超家族成员特异性激活的Smad蛋白作为TGF-β信号转导通路下游重要的信号分子，在角膜创伤修复过程中调节细胞的生长、增生、迁移和分化。Smad信号传导是典型的TGF-β信号通路，可直接或与其他通路协同将TGF-β通路的信号从细胞外转导到细胞核内，调控TGF-β在细胞水平介导的多种生物学效应[55]。TGF-β与其受体的结合可以诱导Smad受体磷酸化，导致通过与Smad结合并易位至细胞核内与其他共激活因子、DNA结合并活化启动子。

Sarenac等[56]采用IGF-1干预HCK，发现其可以减弱TGF-β/Smad信号转导，从而抑制HCK向肌成纤维细胞的分化，因此认为IGF-1是抗纤维化治疗的有效辅助手段。而Izumi等[57]则发现IGF-1可以有效刺激TGF-β2诱导的成纤维细胞增生，而不会逆转纤维化。Guo等[58]发现一种特异性阻断TGF-β/Smad的抑制剂Trx-SARA，其可通过阻断Smad途径抑制角膜成纤维细胞的增生，还能阻断TGF-β1刺激角膜成纤维细胞中FN的表达，这也表明FN受到TGF-β1的调节。Chen等[59]发现葡萄糖胺可以靶向诱导角膜成纤维细胞中KLF4因子的表达，抑制了TGF-β1诱导的α-SMA表达，并通过抑制Smad2磷酸化和ERK依赖性信号传导，降低细胞中胶原蛋白收缩能力，表明成纤维细胞向肌成纤维细胞转化减少。

4.3 TGF-β/p38信号通路

TGF-β受体激活下游的信号分子似乎对角膜成纤维细胞中α-SMA和ECM成分的合成起不同的调节作用，其中TGF-β1可有效刺激p38诱导的磷酸化，在角膜纤维化伤口修复中p38蛋白是TGF的重要中间体[60]。Guo等[61]在TGF-β1刺激的人角膜成纤维细胞中添加p38抑制剂，发现α-SMA和其他纤维化基因(FN、TSP-1和Col Ⅲ)表达显著降低，表明p38抑制剂可能会降低角膜伤口愈合过程中ECM中的纤维化蛋白沉积，从而阻止基质细胞转化为肌成纤维细胞；研究还发现阻断p38途径可使肌成纤维细胞变回成纤维细胞，表明p38抑制剂可能是一种潜在的预防或治疗人角膜纤维化的药物。

4.4 miRNA相关信号通路

角膜基质细胞纤维化的发生及发展涉及多种相关调节因子，是一个十分复杂的过程。有研究发现特异性地上调HCSCs内miR-29a-3p的含量，可以抑制HCSCs向成纤维细胞和肌成纤维细胞转化，或可抑制或延缓角膜组织纤维化的发生和发展[62]。与健康角膜细胞相比，人角膜瘢痕组织和TGF-β1诱导的角膜肌成纤维细胞中miR-145的表达增加了13倍。TGF-β1可以促进miR-145的表达，通过下调KLF4(一种已知的α-SMA的负调节因子)间接诱导α-SMA表达，抑制miR-145显著降低了TGF-β1分泌和肌成纤维细胞的收缩力。因此，miR-145在TGF-β1刺激的角膜肌成纤维细胞分化和活化中起重要作用，有望用于预防或治疗角膜纤维化引起的视力丧失[63]。

与静息状态的HCSCs相比，角膜肌成纤维细胞中的LINC00963表达量减少一半，LINC00963的过表达抑制角膜肌成纤维细胞的形成。研究发现LINC00963可以通过下调miR-143-3p的表达来抑制角膜成纤维细胞中TGF-β1诱导的α-SMA表达。此外，无论是促进LINC00963还是抑制miR-143-3p的表达都可以显著降低肌成纤维细胞收缩性以及Col Ⅰ和Ⅲ的分泌，这是导致角膜纤维化的关键[64]。

综上所述，HCSCs的表型转化对于人角膜损伤修复过程所引起的瘢痕组织形成和角膜透明度降低等方面具有至关重要的作用。因此，深入研究HCSCs表型转化的分子机制及干预角膜瘢痕形成的调控机制，有助于临床防治患者角膜纤维化和术后角膜混浊，为发现新的临床治疗手段提供理论指导。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

志谢本文得到了美国哈佛大学医学院Schepens研究所Zieske实验室和Ciolino实验室的共同指导和帮助