张慧颖,王颖,韩成贵
(中国农业大学植物保护学院,北京 100193)
民以食为天,粮食是人类维持日常生活最基本的生存资料,粮食的生产占据了农业国民经济中的基础地位。中国国土广阔,人口众多,人均耕地面积较少,并且在土地资源中农用土地资源占比较小,后备耕地资源严重缺失,粮食问题仍然严峻。因此,如何提高粮食作物的产量,改良粮食作物的品质,让人们不仅能够吃饱饭,而且可以吃好饭,一直是相关科研人员关注的问题和重点研究的方向。使用转基因技术培育粮食作物新品种,可以突破物种间隔离,将有利基因和性状高效利用,有效地提高作物产量,改良作物品质,在主粮作物中具有较为广泛的应用潜力。
为了提高主粮作物的产量并改良其品质,研究人员可以通过传统的杂交育种方法培育作物新品种。但是传统的杂交育种技术的随机性较高且效率较低,如果通过传统杂交育种手段将多种不同基因控制的优良性状聚合到同一植株中,需要花费多年时间经历多次杂交才可以完成,需要的时间成本较大。此外,并不是所有的目标基因均可以在野生株系中找到,此时,转基因技术的出现弥补了传统杂交育种方法的不足,大大提高了遗传育种改良效率和范围[1]。
转基因主要是通过以下步骤完成。首先要挖掘获取目标性状控制基因并对其进行克隆,然后根据作物的密码子偏好性构建合适的载体并进行重组转化,将重组的DNA转入目标作物的细胞中,接着对作物植株进行筛选,初步获得转基因成功的作物植株,之后需要对转基因作物进行进一步的鉴定,判断其是否达到了预期的效果[2]。
通过转基因技术可以把研究人员前期从其他动植物或微生物体内分离出的目标性状基因通过DNA 重组和遗传转化技术导入到目标植株的基因组中,使得目标植株具有原来没有的优良性状,如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等,并可以保持稳定遗传,通过这种方法培育出的植株即为转基因植物。
植物转基因亦称植物基因工程,其研究的关键是利用重组DNA、细胞组织培养或种质系统转化等技术,将外源基因转化导入植物细胞或组织,使之进行遗传物质的定向重组,改良植物的性状,培育优质高产的作物新品种。首例转基因植株于1983年诞生,自其之后植物基因工程已在人工控制下定向改良植物的遗传性状研究领域具有广泛的应用。在主要粮食作物的种植过程中会受到多种病虫害的危害,同时还会受到不良生长环境的影响,影响作物的产量和品质。通过转基因技术培育抗病虫作物,可以绿色有效地对病虫害进行防控,有利于提高作物产量,改良作物品质,提高农民的收入,提高土地的使用效率[3]。
与常规育种方法相比,通过转基因技术培育具有优良性状的作物新品种。首先,该技术摆脱了亲缘关系的限制条件,可实现动植物及微生物之间的遗传物质的交流,从而充分对自然界中存在的各种遗传资源加以充分利用;其次,该技术方便快捷地打破有利基因与不利基因之间的连锁关系,使对有用基因的利用得以充分实现;最后,该技术可以有效地加快育种研究进程,大大缩短育种所需年限。该技术突破了传统杂交技术的不稳定性并使研究人员可以根据人们的需求将性状优良的外源基因转入植株体内并使其稳定遗传,通过培育转基因植物,可以有效增加农作物的产量,改善农作物品质,有效提高作物的抗病性、抗逆性、抗虫性,降低生产成本,减少化学农药对环境的污染,提高农民的经济效益。
ISAAA(国际农业生物技术应用服务组织)的数据显示,全球范围内转基因作物的种植面积从1996年的170 万hm2增长到2019 年的1.904 亿hm2,其中以转基因大豆和转基因玉米为主要作物,两者在全球范围内均占据了较大的种植面积。转基因技术的应用有效推动了社会经济的发展,提高作物生产力,促进全球粮食、饲料和纤维安全,提高土地利用率,支持国家耕地的自给自足,有效保护生物多样性并能够缓解气候变化所带来的相关挑战,给农业生产带来了一场新的革命。
2009年玉米全基因组测序完成,为研究玉米基因的功能创造了条件,也方便了研究人员使用生物技术手段进行玉米分子育种,在分子水平上对玉米性状进行遗传改良,玉米转基因技术的发展迎来了新的机会[4]。
转基因玉米是使用DNA 重组和基因克隆技术将外源目标基因导入到玉米植株中,使其产生定向稳定的遗传,其后代即为具有稳定遗传性状的玉米品系[5]。研究人员在玉米生产中致力于提高玉米的产量、提高玉米的抗病性和改良玉米的品质和口感,通过农杆菌介导的转基因技术可以培育具有除草剂抗性、抗病性、抗虫性和品质优良的玉米品种[6]。
玉米的生长发育过程中会受到杂草的影响,杂草会与玉米竞争水分、肥料和光照,对玉米的正常生长发育产生影响,进而影响玉米的产量和品质。由于玉米的株型较高大,在种植生产中多采用喷施除草剂的方式来进行除草。喷施除草剂虽然大大减少了杂草管理所耗费的时间和成本,但同时也会对种植的农作物产生不利影响。基于此,研究人员深入挖掘抗除草剂基因资源,利用遗传转化的方法将除草剂抗性基因(如从链霉菌中提取的具有草丁膦除草剂抗性的bar 基因)转移到玉米基因组中,培育抗除草剂玉米品种[7]。此外,研究人员发现,通过农杆菌介导将具有杀虫活性的抗虫基因和除草剂抗性基因bar或cp4-epsps共转入玉米中,获得的转基因植株表现出较强的对害虫及除草剂双重稳定的抗性[8-9]。通过这种方法可以有效拓宽除草剂的施用范围,使其可以在不伤害作物本身的前提下有效地进行杂草管理。
病虫害一直是影响作物产量的一个重要因素,中国是玉米的种植大国,但同时也是玉米螟的多发重灾区,玉米受玉米螟危害严重,几乎每2年就会发生一次大型虫灾,其中由于玉米螟危害造成的产量损失可达5%左右[5]。玉米钻心虫也是危害玉米的主要害虫之一,它不仅可以危害玉米茎叶,还会对玉米的果实产生直接危害,给农户带来巨大的经济损害。通过转基因技术将抗虫基因转入玉米植株中,可以培育出对相应害虫具有抗性的玉米品种,通过该方法不仅可以有效控制害虫危害,还可以有效降低玉米种植过程中农药的施用量,从而促进玉米的安全生产,提高农户的经济效益[2,10-11]。
抗虫转基因玉米主要是通过将Bt 毒蛋白或抗虫基因转入到玉米基因组中,使玉米获得对相应害虫的抗性,大幅度降低虫害。Bt毒蛋白是一种存在于孢晶体中的原病毒,芽孢在成型的过程中会产生一种杀虫晶体蛋白,当敏感的昆虫取食转基因植物时,Bt 原毒素也随之进入昆虫的消化道,在昆虫的肠道内被肠胃碱性蛋白酶水解成毒素分子,这种活化的毒素分子会促使昆虫停止取食而引起昆虫的死亡[5]。此外,研究人员还通过对苏云金芽孢杆菌进行筛选,分离克隆cry抗虫基因,培育抗虫转基因玉米,如Cry2Ab、Cry1A.105、Vip3A和Cry1F等均为商业上可用的Bt蛋白基因[1,10-12]。例如,研究人员发现转cry1Ah抗虫玉米对亚洲玉米螟具有显著抗性,并且转入的外源基因可以在玉米植株中稳定表达和遗传,植株在田间的农艺性状表现良好[13-14]。通过室内和田间抗虫实验发现,转cry1Ac抗虫玉米可以显著降低亚洲玉米螟的危害,初孵玉米螟幼虫在取食后6~7 天的存活率普遍低于15%。此外,研究人员通过实验发现转Bt-cry1Ab 和Bt-(cry1Ab+vip1Aa)抗虫玉米对草地贪夜蛾1~4 龄幼虫均具有较好的防控效果[15]。
此外,研究人员还对抗虫抗除草剂玉米展开了研究,将抗虫基因和抗除草剂基因均转入玉米中,使其产生对害虫和除草剂的双重抗性,目前在该领域的的研究已经取得了较多进展。2019 年农业农村部批准了杭州瑞丰生物技术有限公司和浙江大学联合研发的转cry1Ab/cry2Aj和g10evo-epsps基因抗虫耐除草剂玉米‘瑞丰125’在北方春玉米区生产应用的安全证书。2020年,农业农村部先后批准了大北农研发的转epsps和pat基因耐除草剂玉米‘DBN9858’和‘DBN9936’在北方春玉米区、黄淮海夏玉米区、南方玉米区、西南玉米区和西北玉米区生产应用的安全证书。其中‘DBN9936’对危害玉米的玉米螟等主要鳞翅目害虫具有良好的抗性,同时能耐受常用剂量4 倍的草甘膦且对生态环境无不良影响,具有较高安全性[16]。‘DBN9858’则为前者的配套庇护所,主要是为了防止害虫对转基因品种产生抗体,2个玉米品种配合使用,在提供绿色高效玉米害虫防控的同时,还可有效延缓靶标害虫的抗性产生,延长产品使用寿命,有利于生态可持续发展。2021 年12月,大北农研发的聚合cry1Ab、epsps、vip3Aa19、pat 基因的抗虫耐除草剂玉米品种‘DBN3601T’(‘DBN9936’בDBN9501’)在西南玉米区生产应用的安全证书也通过了农业农村部的审批。
作为玉米的种植大国,中国玉米的产量较高,但品质普遍不好,玉米籽粒中的蛋白质和赖氨酸含量较低。使用转基因技术对玉米品质改良,主要是通过克隆外源蛋白基因来提高玉米品质,实现定向定量改良玉米的淀粉含量、纤维素含量、赖氨酸含量和蛋白质含量等目标,从而有效提升玉米口感,提高营养价值。
研究人员发现,将富含赖氨酸的马铃薯花粉特异水溶性蛋白对玉米种子进行转化,即可将玉米中的赖氨酸含量提高10%以上[5,17]。岳静等[18]从陆地棉的基因组中克隆了一个高赖氨酸蛋白(GhLRP)基因,通过农杆菌介导将该基因转化到玉米植株中,发现转基因玉米的赖氨酸含量与野生型相比有了不同程度的提高,同时该研究还对转基因株系的后代材料进行追踪,发现该基因可以在后代株系中稳定遗传,具有较大应用潜力。2014年,农业农村部批准了中国农业科学院生物技术研究所的转植酸酶基因玉米‘BVLA430101’在山东省生产应用的安全证书,通过培育转植酸酶玉米可以有效改良玉米对土壤中磷的吸收量[19]。通过农杆菌介导法将ssnhx1、sber2-1 等基因转化到玉米植株中可以显著提高转基因玉米的耐盐性和抗旱性[20-21]。此外,通过转基因技术也可以对玉米的籽粒大小进行精准调控,此举不仅可以提高玉米的产量,还可以有效改善玉米的外观品质,在玉米育种中有较广泛的应用[2]。
在小麦的生长过程中,病虫草害的存在会严重影响其正常的生长发育。较多杂草的存在会与其争夺水分、肥料、光照和生长空间,对其正常的生长发育产生影响。虫害和病害亦是对小麦产量影响最大的因素,麦蚜虫、小麦锈病、小麦赤霉病、小麦白粉病及小麦黄花叶病等病虫害给小麦生产造成巨大的损失[22]。基于此背景,培育与改良小麦品种变得尤为重要,转基因技术在其中发挥了重大作用。
中国对转基因小麦品种的培育非常重视,设置了国家“863 计划”、“转基因植物研究与产业化专项”和“转基因生物新品种培育重大专项”等资助项目,在其资助下中国转基因小麦研究尤其是理论上取得了很大进展。
在小麦生产过程中通常会采用除草剂对杂草进行防治,避免其对小麦的正常生长产生影响,这样的处理方式虽然可以显著地提高除草效率,但除草剂的施用也会对农作物的生长和周边环境产生伤害。此时,挖掘抗除草剂基因,培育抗除草剂小麦就成了研究的重点。抗除草剂小麦主要是通过将具有抗除草剂特性的epsps、bar等基因转移到小麦内部而获得,小麦经过改良后就会产生抗除草剂的抗性,促进小麦的稳定生长[23]。
中国关于抗虫转基因小麦的研究相对较少,目前应用于抗虫小麦品种培育的主要有2 种方法,一种是将大麦胰蛋白酶抑制基因或丝氨酸蛋白酶抑制基因转入小麦中,可以获取对虫害有一定抗性的小麦品种;另一种是将外源凝集素相关基因转入小麦中,凝集素是活性蛋白和特异性糖相互结合的一类蛋白,对麦蚜虫具有较强的抗杀和阻滞作用,由此也可以获取对虫害具有一定抗性的小麦品种[24-25]。
研究人员发现,转化雪花莲凝集素gna 基因的小麦表现出明显加强的蚜虫抗性[26]。徐琼芳等[27-28]使用基因枪法获得了雪花莲凝集素gna 和bar 基因转化的转基因小麦,该小麦表现出较好的抗虫和抗除草剂功能。段晓亮等[29]通过基因枪法将雪花莲凝集素基因sgna、中国水仙凝集素基因sntl 和半夏凝集素基因pta转化进普通小麦品种,发现这3 种转基因小麦均具有较好的抗蚜虫效果。使用转基因技术可以快速高效地获得小麦抗虫品种,提升小麦对虫害的抗性,降低虫害对小麦的影响,可以有效提升小麦的品质和产量。
转基因技术是可应用于抗病转基因小麦培育过程中的一种非常高效的技术手段,在生产研究中通常将多种与抗病或病程相关的基因进行聚合并转化到小麦中,通过此法可以培育出具有较强抗病性的小麦品种。
研究人员发现,通过农杆菌介导的转TaTLP1 蛋白基因小麦表现出对叶锈病的较强抗性[30],转WYMVNib8 蛋白基因小麦对小麦黄花叶病具有较强抗性[31],将存在于大麦中的几丁质酶基因和曲霉素抗菌蛋白基因一起转入小麦植株中,可以有效降低小麦白粉病的发病率和叶锈菌孢子的形成概率,获得对小麦白粉病和小麦锈病具有一定抗性的转基因植株[24,32]。此外,研究人员发现,来源于簇毛麦的pm21 是目前所有小麦白粉病抗性基因中抗白粉病表现最佳的,且在遗传背景不同的小麦中均有非常稳定的表现[33]。抗菌肽(AMPs)是一类具有广谱抗菌性的小肽,将编码DmAMP1W蛋白的基因转入小麦品系中,结果显示转基因小麦对纹枯病和普通根腐病均表现出较强的抗性[34]。经过挖掘和研究小麦相关抗病基因,并使用转基因技术进行转化,可以培育出具有较高抗性的转基因小麦品种,有效提升小麦的产量与品质。
随着时代的发展,人们已经不仅仅是追求小麦的产量,还希望小麦的品质可以根据人们的需求得到相应改善,便于进一步的再加工和食品生产。使用转基因技术手段可以有效改善小麦的品质和口感,改善小麦的籽粒硬度和籽粒中的淀粉含量,还可以对小麦的营养结构进行优化,生产出更符合大众需求的小麦。例如,研究人员将ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基因导入小麦植株中可以有效促进小麦籽粒中淀粉的合成[24]。通过在小麦中过表达V 型焦磷酸酶基因edvp1可以有效改善小麦品系对钾元素的吸收量,提高小麦籽粒产量[35]。
在水稻的生长发育过程中,病害的发生会对水稻的生长产生影响,例如水稻白叶枯病、稻瘟病、纹枯病、稻曲病和矮缩病等,这些病害的发生均会对水稻的产量和品质产生影响[36]。虫害也是制约水稻生产的一个主要生物因素,在水稻生长发育期间主要危害的虫害是二化螟、三化螟、褐飞虱和稻纵卷叶螟等,即使在现有防治水平下,中国每年因虫害造成的水稻产量损失依然非常高。使用传统手段对病虫害进行防治虽然也有较好的防治效果,但同时会增加经济成本并会对自然环境造成污染,因此使用转基因手段对水稻品种进行改良,培育抗性水稻品种具有较大的应用价值。
转基因水稻,是指将不同品种的水稻或近缘物种中的抗性基因通过转基因技术转入水稻基因组内培育新的具有较高安全性的水稻品种[37-38]。转基因水稻的研究开始于20世纪后期,至今中国国产的多种转基因水稻品种已经在美国获得食用许可,在理论与应用研究方面均取得了重大的突破。
使用转基因技术可以培育具有较高抗性的水稻品种,研究人员通过前期实验挖掘使用转基因技术将抗病基因转化进水稻植株中获得抗病品种。例如,xa21和xa23均为抗性较强、抗谱较广的水稻白叶枯病抗性基因[39-40],pi1、piz-5、pi-ta 和pi-b 为抗性较强的稻瘟病抗性基因[41],将其转化到水稻植株中大大缩短了传统育种手段培育抗病新品种的时间。
目前,对于水稻虫害的防治主要还是依赖化学农药,这不仅会增加农民的生产成本、减少种粮收益,还造成环境污染、农药残留、害虫抗药性增强以及杀伤天敌等一系列生态环境问题。所以,培育抗虫品种,特别是培育对多种害虫均具有抗性的品种,是控制水稻虫害的最经济有效的防治手段。
目前在水稻自身中并未发现合适的优异的抗虫基因,但是研究人员从苏云金芽孢杆菌中分离出的Bt毒蛋白基因和蛋白酶抑制剂基因均表现出优异的抗虫性,具有较好的杀虫效果[42-43]。研究人员将这些表现优异的外源基因通过农杆菌介导法、基因枪法等转入水稻植株,并对转基因植株进行筛选鉴定,从而培育出新的抗虫转基因水稻品种。目前研究人员已通过该方法培育出了性状优良且具有较强抗虫性的水稻品种,如‘华恢1 号’、‘明恢86’和‘Bt 汕优63’等[1,43-45]。2014年,农业农村部审核批准了华中农业大学申报的转cry1Ab/cry1Ac 基因的抗虫水稻‘华恢1 号’、‘ Bt 汕优63’在湖北省范围内生产应用的安全证书。
水稻的品质主要由4 个方面组成,分别为碾磨品质、外观品质、蒸煮食用品质和营养品质。碾磨品质主要指的是收获后的稻谷在经过机器加工后,得到的糙米、精米和整精米的数量。外观品质主要包括整精米的粒型(用长宽比表示)、垩白粒率、垩白度和透明度。蒸煮食用品质主要包括糊化温度、直链淀粉含量、胶稠度、米粒延伸性和香味。食用稻米一般以中或低糊化温度为好,直链淀粉含量以低或中为宜。营养品质主要包括精米中蛋白质含量和赖氨酸含量,如‘华粳295’和‘华两优2890’均为品质较好的优质稻谷品种。在改善稻谷品质中,以对外观品质、蒸煮食用品质和营养品质的研究居多,通过前期研究和挖掘相关的品质调控基因,研究人员使用转基因技术将目标基因转化到水稻植株中,从而获得品质较好的水稻品种。例如研究人员通过转基因技术将合成β-胡萝卜素(合成维生素A 的前体)代谢途径中的关键酶类基因(psy、crtl)转入水稻,成功培育出富含维生素A的黄金米,大大提高了稻米的营养价值[46]。研究人员还利用T-DNA 双元载体将可溶性淀粉合成酶SSSII-2 与潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因一起导入优质粳稻品种,对SSSII-2 进行RNA 干扰(RNAi),使其表达显著下调,导致胚乳的直链淀粉含量降低,从而获得了可选择的无标记(SMF)转基因水稻品系,且其籽粒外观透明,淀粉理化特性和RVA 特性与当前软米品种相同[47]。此外,通过将能够提高作物耐热性的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C9(AtPLC9)在水稻中进行异源表达,发现转基因水稻表现出较强的耐热性,将OsNAR2.1 和OsNRT2.3a 基因在水稻中共过表达可以提高水稻产量和氮素利用效率[48-49]。
作为中国的一线大宗临床用药,人血清白蛋白(HAS)具有重大的临床上应用价值,广泛应用于肝硬化腹水、脑水肿、手术后补充体液、烧伤烫伤、失血过多导致的休克、癌症和艾滋病人放化疗的辅助治疗等领域,存在巨大的市场需求,因此各国科学家都在挖掘寻找一种不依赖血浆且安全廉价的重组人血清白蛋白技术。
杨代常团队通过研究发现,可以通过对水稻种子进行改造生产制造出大量的人血清白蛋白,其蛋白含量占据水稻种子的总可溶性蛋白的10%左右。水稻胚乳生物反应器技术主要是利用转基因技术来对水稻进行改造,将水稻的胚乳视为蛋白质的生产车间来表达和生产重组蛋白质或多肽。水稻胚乳细胞含有非常完整的真核细胞蛋白质加工模式,其重组蛋白质的翻译、折叠与修饰过程均与哺乳细胞非常相似,并且水稻具有清楚的生物学背景,目前未发现任何与动物病原菌或病毒入侵植物细胞与人共患相关的报道,因此使用水稻表达重组蛋白质具有很好的安全性和可行性。
该课题组根据人血清白蛋白氨基酸序列,人工合成了水稻偏爱密码子的人血清白蛋白基因全序列,对其进行克隆并构建水稻转化载体pOsPMP114后,将其导入水稻植株,获得转基因株系。之后,通过Western blotting检测筛选出在水稻胚乳中表达OsrHSA较好的转基因纯合品系并通过多技术手段对其表达产物进行验证,证明其表达的OsrHSA 具有与人血清白蛋白相同的高级结构和构象,经过进一步医学检验证明其可进一步应用于临床,解决国内人血清白蛋白供应紧张的局面[50]。
转基因技术的应用在解决人类面临的农业问题和环境问题等方面发挥了巨大的作用。通过转基因技术培育作物品种,有效提高作物产量和品质,为农作物育种提供了一种全新的技术和方法。
提高作物产量依旧是首要目标,由于产量是数量性状,若想更大幅度地提高作物产量,可以通过转基因技术对控制作物产量的基因进行聚合,将聚合后的多基因导入农作物植株,使其获得更大的生产潜力。
农作物生长发育期间会遭遇多种病虫草害危害,现有的抗性品种多为单一抗性,仅对某种单一的病害或虫害具有较强抗性。为了更好地应对病虫草危害,提高作物的综合抗性,可以通过转基因技术对多种病虫害的抗性基因进行聚合,将多个抗性基因整合到作物基因组中,培育可以同时抵抗多种病虫害危害的多抗转基因作物。ISAAA的数据显示,2019年具有多种抗性的作物品种在全球范围内具有较大的种植面积,如抗虫/抗除草剂(IR/HT)复合性状品种增长了6%,为8510 万hm2,超过了原本种植最广泛的耐除草剂性状品种(8150 万hm2),说明多抗性品种具有较大的应用价值和前景[51]。
如今,整个社会都在倡导践行节约资源、保护环境,在农作物生产过程中也可以积极响应这一号召。通过转基因技术培育具有较好抗逆性、抗病虫性和高产的作物品种,在保证一定产量的基础上,减少作物生长发育过程中农药的喷施和水资源的损耗,节约资源,保护环境[52]。
转基因作物品种在减少生物和非生物胁迫造成的损害方面发挥了重要作用,有望为全球消费者提供越来越多的高质量农产品,但是人们对转基因作物的生物安全性一直持怀疑态度,普遍认为为了提高转基因作物品种的安全性,必须消除用于帮助完成转基因过程的标记基因,还应当确定转基因的插入位点,即农杆菌介导的转化在植物中的T-DNA整合位点及其对临近基因表达的潜在影响,因此培育无标记、转基因插入位点确定的转基因作物对转基因作物的安全应用至关重要[53-54]。
目前在全球主要转基因作物范围内,以转基因玉米和转基因大豆的种植面积较广泛,并且转基因玉米品种获得审批数量最多,大豆与玉米的转基因作物生产体系已初具雏形,具有完善的研究背景和技术手段,在此基础上未来也许会有更大的突破。转基因技术除了在农作物育种中发挥巨大作用外,还可以在其他领域发挥作用。利用转基因技术构建植物生物反应器、生产畜禽的植物基因工程疫苗也是新兴的研究领域,与其他疫苗相比,转基因植物疫苗具有廉价、安全、有效等优点。利用转基因植物作为环境污染监测的报警器,在环境出现重大生态损伤之前预告其可能存在的风险,同时还可以对污染地区修复效率做出评估,也是当前转基因植物利用的新方向。作为人类历史上应用最为迅速的重大技术之一,转基因技术的应用将会为未来农业的发展带来更大的契机和影响。