林龄和林分密度对华北落叶松人工林土壤养分和细菌群落的影响

李雪，王静，张静，张菲，张志东

（1.河北农业大学 a.林学院；b.河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000；2.河北省塞罕坝机械林场，河北 围场 068450）

土壤养分能够为植物生长提供所必需的营养元素，是土壤肥力的重要体现，对林分生产力产生重要的影响。林龄是影响土壤养分循环的重要因素[1],华北落叶松人工林演变过程中，是否出现地力衰退尚未达成共识。研究表明，华北落叶松人工林土壤碳、氮、磷等养分含量随林龄增长呈增加[2]、减少[3]或先增后减[4]的变化趋势。林分密度也能够影响土壤养分含量[5]，刘玲[6]通过研究不同密度的长白落叶松Larix olgensis天然林发现，当林分密度为800～880 株/hm2时，土壤全碳、全磷和有效磷含量高于其他林分密度；也有研究表明，随着林分密度的增加，土壤有机质、全氮、全磷含量呈现先增大后减小的趋势[7]。由此可见，落叶松人工林土壤养分随林龄和林分密度的变化趋势仍有不确定性。

土壤微生物在有机质分解、养分转化和维持生态系统稳定等方面发挥着至关重要的作用。林龄导致土壤微生物群落结构和多样性发生变化。有研究表明，微生物α多样性指数随林龄增加呈增加[8]或先增后减[9]的变化趋势。土壤微生物群落结构和多样性影响土壤养分的转化[10]。土壤微生物群落组成受不同土壤养分指标的影响程度不同。研究表明，华北落叶松土壤理化性质和微生物群落有一定相关性,其中细菌数量与全氮的相关性最高[11]。落叶松Larix gmelinii人工林土壤pH值和养分均对土壤微生物群落组成有显著影响，其中全磷和速效磷的影响较大[12]。土壤微生物群落多样性和土壤pH 值呈负相关,和土壤养分呈正相关[13]。土壤微生物群落特征可以作为土壤质量变化的敏感指标，通过研究微生物群落组成和多样性的变化对维持人工林地力具有重要意义。目前，有关华北落叶松人工林林龄和林分密度耦合对土壤微生物的研究仍较少。华北落叶松由于其耐寒、喜光以及对不良气候抵抗性较强，木材品质好，已成为冀北山地重要的造林树种。然而，人工林质量不高，土壤养分维持问题一直困扰森林经营者[14]。目前，已有研究单独考虑林龄或林分密度对华北落叶松土壤养分和微生物多样性的影响，而综合林龄和林分密度进行分析的研究相对较少。本研究以内蒙古苏木山林场华北落叶松人工林为对象，分析不同林龄和林分密度对土壤养分、细菌群落结构变化的影响，拟为华北落叶松人工林科学经营提供理论依据。

1 研究区概况与研究方法

1.1 研究区概况

研究区位于内蒙古自治区乌兰察布市兴和县苏木山林场（40°26′53″～40°39′30″N，113°38′33″～114°02′27″E），地处阴山山脉南北麓交错地带，地貌为中低山地，海拔1 500～2 300 m，年降水量400～450 mm，年平均气温4.2℃，最高温度33℃，最低温度-29.5℃，无霜期110 d，属于半干旱大陆性季风气候，林下土壤以灰褐土为主。苏木山林场是内蒙古中西部最大的人工林场，其中林分类型以华北落叶松人工林为主，占苏木山林场总经营面积的56.13%。

1.2 试验设计

采用分层随机取样的方法，于2019 年8月，在苏木山林场选取了3 种林龄（15、25 和37 a）和低（500～700 株/hm2）、中（1 200～1 500 株/hm2）、高（2 000～2 300 株/hm2）3 种林分密度的华北落叶松人工林，样地大小为30 m×20 m，每个类型样地各3 块，共27 块。测量并记录胸径、树高、坡度、海拔等信息（表1）。用酒精湿巾将土钻和网筛进行消毒灭菌处理，沿样地两个对角线随机确定5 个取样点，去除凋落物，使用土钻取0～5 cm 土层的土壤，过孔径为0.85 mm 的网筛，将同一块样地过筛后的土样等量混合，每份样品取10 g，保存在离心管中，放在冰箱-80℃储存备用。剩余土壤取100 g 在常温下保存，用于养分测定。

表1 样地基本情况†Table 1 Basic conditions of sampling plots

1.3 土壤养分测定

根据《土壤农化分析》[15]，土壤全氮含量采用半微量凯式定氮法测定；全碳采用氧化法测定；全磷和速效磷采用钼蓝比色法测定；全钾和速效钾采用火焰光度计测定；土壤pH 值采用pH 计测定。

1.4 土壤细菌高通量测序

使用Mag-bind soil DNA kit土壤DNA试剂盒（OMRGA）提取土壤DNA，并将提取的样品统一稀释至20 ng/μ。使用细菌16SV3V4 区的上游引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和下游引物806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT) 进行PCR 反应，扩增体系共25 μL:5×reaction buffer 5 μL,5×GC buffer 5 μL,dNTP（2.5 mM）2 μL,Forwardprimer（10 μM）1 μL,Reverseprimer（10 μM）1 μL,DNA Template 2 μL,ddH2O 8.75 μL,Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。PCR 反应条件为：98℃预变性2 min；25～30 个循环包括（98℃，15 s；55℃，30 s；72℃，30 s；72℃，5 min）；退火温度会进行调整以确定最佳温度，循环数会根据样品本身进行微调，以确保使用最少的循环扩增出合格的目标条带。

将PCR 产物进行纯化、定量和均一化，构建文库进行测序，测序得到的PE reads 首先根据Overlap 关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样品后进行OTU 聚类分析和物种分类学分析来确定样本细菌在门水平上的群落组成。

1.5 数据分析

采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和最小显著差异法（LSD）对不同林龄和密度的林分土壤养分和细菌群落多样性差异进行显著性检验，显著水平设定为α=0.05；采用主成分分析法对土壤肥力进行综合评价。

利用Uparse 软件对所有微生物样品进行聚类。采用Mothur 方法进行物种注释分析，获得分类学信息并在门（phylum）分类水平上统计各样本的细菌群落组成。使用Qiime 软件计算Chao1、Pielou、Shannon 和Simpson 等多样性指数，并用Origin 8.1 软件作图。采取R 软件的vegan 软件包中的冗余分析（Redundancy analysis，RDA）解释土壤养分与细菌群落之间的关系。将土壤养分与细菌群落进行Pearson 相关分析。

2 结果与分析

2.1 土壤养分变化

不同林龄相同密度林分的养分指标差异显著（P＜0.05）（表2）。在低密度林分中，随着林龄增加，土壤全氮、全碳、速效钾含量呈先增后减的变化趋势，全磷和速效磷含量呈上升趋势，且15 a 林分土壤全磷含量显著低于37 a 林分。25 a 林分土壤pH 值显著低于15 和37 a 林分；在中密度林分中，随着林龄增加，全氮、全碳、全磷、速效钾、速效磷含量呈上升趋势，37 a 林分全磷含量显著高于15 和25 a 林分。15 a 林分全氮和全碳含量显著低于25 和37 a 林分。随着林龄增加，pH 值先降低后缓慢上升；在高密度林分中，随着林龄增加，土壤全氮、全碳、全磷、速效磷含量呈上升趋势，15 a 林分速效磷含量显著低于37 a林分，pH 值随林龄的升高而降低。

表2 不同林龄和林分密度林分土壤养分†Table 2 Soil nutrients in stands with different stand ages and densities

相同林龄不同密度林分的养分指标差异显著（P＜0.05）。在15 a 林分中，全氮、全碳、全磷、全钾、速效磷含量随密度增加呈先降低后升高的趋势，差异不显著（P＞0.05）；在25 a 林分中，中密度林分全氮和全碳含量显著高于高密度林分，中、高密度林分全磷含量显著高于低密度林分；在37 a 林分中，中、高密度林分全氮含量显著高于低密度林分，中密度全碳和速效钾含量显著高于低、高密度，不同林分密度的全磷、全钾和pH值没有显著差异（P＞0.05）。

对土壤因子全氮（X1）、全碳（X2）、全磷（X3）、全钾（X4）、速效钾（X5）、速效磷（X6）和pH值（X7）共7 个指标进行主成分分析，第1 主成分与第2 主成分的累积贡献率达78.91%（表3），说明前2 个主成分解释效果较好，能够充分反映不同林分土壤质量间差异。对因子载荷的权重换算得出2 个主成分方程：F1=0.446X1+0.390X2+0.404X3-0.2 4 4X4+0.4 4 1X5+0.3 6 1X6-0.3 8 6X7；F2=0.036X1+0.316X2-0.041X3+0.886X4+0.115X5+0.119X6+0.294X7。综合得分F的计算公式为F=0.631F1+0.158F2。

表3 土壤因子前2 个主成分特征值及相关系数Table 3 The top two principal component eigenvalues and correlation coefficients of soil factors

利用以上方程计算主成分得分后，以各主成分的方差贡献率为权数进行加权求和，不同林龄和林分密度的土壤肥力综合得分和排名（表4）可知：不同林龄的林分随密度变化趋势存在差异。对于15 a 林分来说，当密度为2 000～2 300 株/hm2时，土壤肥力最高，林分密度为500～700 株/hm2时，土壤肥力最低；对于25 a 林分来说，当林分密度为1 200～1 500 株/hm2时，林分土壤肥力最高，林分密度为2 000～2 300 株/hm2时，土壤肥力最低；对于37 a 林分来说，当林分密度为1200～1500 株/hm2时，林分土壤肥力最高，林分密度为500～700 株/hm2时，土壤肥力最低。整体上来说，土壤综合肥力最高的是37 a 林分，其次为25 a 林分，15 a 林分的土壤肥力最低。

表4 不同林分土壤肥力水平综合得分Table 4 Integrative scores of soil levels in different stands

2.2 土壤细菌群落组成和结构分析

不同林龄华北落叶松人工林土壤细菌群落组成存在显著差异，不同林分密度的细菌群落差异不显著（图1）。第一坐标轴解释了样本差异的27.4%，第二坐标轴解释了样本差异的8.4%，二者共解释差异的35.8%。在PC1 中，15 a 林分与25 a、37 a 林分距离较远，细菌群落结构差异较大。25 a和37 a 林分距离较近，细菌群落组成较为相似。在PC2 中，不同林分细菌群落组成无显著差异。

图1 不同林分土壤细菌群落组成结构的主成分分析（PCoA）Fig.1 Principal component analysis (PCoA) of soil bacterial community composition of different stands

通过Illumina 高通量测序，共检测出土壤细菌门30 个。其中相对丰度大于10%的优势细菌门分别为变形菌门、酸杆菌门和放线菌门,占到了细菌门的67.37%～76.32%。相对丰度大于1%的细菌门有10 个（图2）。15 a 林龄的变形菌门相对丰度显著低于37 a（P＜0.05）。15 a 酸杆菌门相对丰度显著低于25 a 和37 a 林分，而放线菌门则相反（P＜0.05）。不同林分密度间的优势细菌门的相对丰度差异不显著，不同林龄和林分密度的非优势菌门相对丰度无显著差异（P＞0.05）（表5）。

图2 不同林龄和林分密度的林分门水平土壤细菌相对丰度Fig.2 The relative abundance of soil bacteria in the plantations with different stand ages and densities

表5 不同林龄和林分密度的林分优势菌门相对丰度†Table 5 Relative abundance of dominant phyla in the plantations with different stand ages and densities %

2.3 土壤细菌群落多样性变化

不同密度林分的Chao1、Shannon 和Simpson指数均随林龄增加而增加，且存在显著差异，而Pielou 指数没有显著差异（图3）。随着林龄增加，土壤的丰富度和多样性指数均呈增加趋势。对于相同林龄林分而言，15 a 低密度林分的Chao1 指数显著低于中、高密度林分，25 和37 a 中密度林分的Chao1 指数均显著高于低、高密度林分；15 a高密度林分的Shannon 和Simpson 指数均高于低、中密度林分，25 和37 a 中密度林分的Shannon 和Simpson 指数均显著高于低、高密度林分。15 a 林分的丰富度和多样性指数随林龄增加而增加，而25 a 林分则呈现出先增加后降低的趋势。

图3 不同林龄和林分密度的林分土壤细菌多样性指数变化Fig.3 Changes of soil bacterial diversity indicators among stands with different stand ages and densities

2.4 土壤养分与细菌群落的相关关系

结合RDA 冗余分析和Pearson 相关性分析可知，第一排序轴解释了样本变异的40.93%，第二排序轴解释了样本变异的2.4%（图4 和表6）。由RDA1 可以得出，土壤pH 值、全氮、全碳、全磷对细菌群落影响较大；由RDA2 可以得出，全钾对细菌群落影响较大。变形菌门与全钾呈负显著相关；酸杆菌门与全氮存在显著正相关；放线菌门与全氮、全碳和全磷显著负相关，与pH 值显著正相关；己科河菌门与全氮和全碳呈正显著相关；拟杆菌门与全碳呈显著正相关，与全钾显著负相关；硝化螺旋菌门与全氮、全碳和全磷呈显著正相关。

表6 细菌与土壤养分相关系数†Table 6 Correlation coefficients between bacteria and soil nutrients

图4 土壤细菌群落与土壤养分的RDA 排序图Fig.4 Redundancy analysis of soil bacterial communities and soil nutrients

3 讨论

3.1 土壤肥力的变化

本研究发现，林龄为15～37 a 的华北落叶松人工林，土壤全氮、全碳和速效磷含量均有增加，这与赵海燕等[2]的研究结果相似，可能是因为落叶松在幼龄林阶段生长迅速，对碳、氮、磷的需求量较大，而枯落物积累量较少，对土壤的养分回馈较少。随林分发育，落叶松凋落物积累量增加，根系不断完善，大量根系死亡和分解的养分回归到土壤中，而林分生长速率逐渐缓慢，对土壤养分的需求相对减少，土壤养分得到积累。已有研究表明，林分密度约为1 402 株/hm2时,土壤质量指数最高[16]。本研究同时考虑了林龄和林分密度两个因素，15 a、25 a 和37 a 林分保持最高土壤肥力的林分密度不同。对于15 a 林分来说，当密度为2 000～2 300 株/hm2时，土壤肥力指数最大，全氮、全碳、全磷、全钾、速效磷含量较高。有学者研究发现，幼龄林阶段，当林分密度较低时，林地光照强度增加，土壤水分散失，养分转化效率降低，土壤养分含量较低；高密度条件下，根系生物量大，能够更好地保持土壤水分，改善土壤养分[13]，与本研究结果相同。25 a 和37 a 林分的密度均为1 200～1 500 株/hm2时，养分含量较高，土壤肥力指数最大，与孙熹等[17]的研究结果相似，可能是因为在中龄林和近熟林阶段，当林分密度适宜时，水热条件好，灌木、草本和凋落物分解较快，能够为林木提供良好的生长空间，林分密度过大或过小都会出现林地土壤退化、酸化等现象[7]。落叶松根系对阴阳离子的吸收不平衡导致土壤释放出H+以维持电荷稳定，导致土壤显酸性[18]。低密度15 a 林分土壤pH 值最高，高密度37 a 林分土壤pH 值最低。随林龄和密度增加，郁闭度增大，大量凋落物积累在土壤表层，凋落物在微生物和土壤动物的分解作用下，产生富里酸水溶液，导致土壤呈酸性，土壤pH 值降低[3]。过酸会抑制土壤微生物的分解活动,从而影响养分的释放，降低土壤肥力[19]。土壤酸化可以通过改变林分树种组成或施加土壤改良剂对土壤pH 值进行调节。

3.2 土壤细菌群落组成和多样性变化

研究表明，随林龄增加，土壤微生物群落结构会发生改变[20]。本研究发现，15 a 林分细菌群落组成与25、37 a 的细菌群落组成差异显著，说明细菌群落发生了演替。不同林龄和林分密度的林分土壤优势细菌门相同。优势细菌门为变形菌门、放线菌门和酸杆菌门，相对丰度远高于其他细菌门类，可能与这3 个细菌门生态位较宽，受环境因素影响较小有关[21]。有研究表明，变形菌门为富营养菌门，酸杆菌门为寡营养菌门[22-23]。在本研究中，苏木山地区的变形菌门的相对丰度均高于酸杆菌门，有利于该地区土壤地力维持。变形菌门能够分解土壤动植物残体，促进氮素的分解和利用[24]。37 a 林分变形菌门的相对丰度显著高于15 a，说明随林龄增加，土壤的固氮能力增强。15 a 林分的放线菌门相对丰度显著低于25 a和37 a 林分，放线菌门与pH 值呈显著正相关，随林龄的增加呈现下降趋势，这与已有研究结果相同[25]，可能是因为放线菌门不适合生长在酸性土壤中。酸杆菌门有嗜酸性，随林龄增加，土壤呈酸化趋势，酸杆菌门相对丰度增加。不同林分密度的细菌门相对丰度没有显著差异，说明林龄对细菌的影响大于林分密度。随林龄增加，细菌丰富度和多样性均升高。有研究表明，随林分发育，林下凋落物和根系生物量增加，细菌多样性较高，与本研究结果一致[26]。细菌丰富度和多样性指数随林分密度的变化与土壤肥力变化趋势相同，细菌丰富度和多样性指数与土壤肥力密切相关[27]。微生物群落多样性指数的大小代表群落稳定性和抵抗力强弱[28],随着林龄增加，华北落叶松林土壤细菌群落抗干扰能力增强。

3.3 土壤化学性质与细菌的关系

土壤微生物通过呼吸、矿化和硝化等代谢活动能够将土壤有机质分解，使之转化成养分以供植物生长发育，改善土壤理化性质[29]。影响不同细菌群落的化学因子不同，可能与其生长所需要的养分不同有关[30]。影响土壤细菌群落结构较大的土壤因子有pH 值、全氮、全碳和全磷含量，其次为全钾。有研究发现，土壤pH 值和全氮对微生物群落结构有重要影响[31]，这与本研究结果相同。对于优势菌群，全钾与变形菌门呈显著负相关，说明全钾可能是抑制变形菌门的重要因子，同时变形菌门受全钾影响显著。酸杆菌适合生长在酸性条件的土壤中，其相对丰度可以用来表示土壤的酸化程度[32]。放线菌门与全氮、全碳、全磷呈显著负相关，与pH 值呈显著正相关，说明放线菌门影响的土壤养分元素种类较多。己科河菌门与全氮和全碳呈正显著相关,说明该菌群可能促进含氮、碳有机质的分解。硝化螺旋菌门与全氮、全碳和全磷呈显著正相关，这可能是由于该菌群是进行硝化作用的重要细菌群落，而且能促进含氮、磷有机质的分解。本研究中，土壤的化学因子解释了土壤细菌群落结构的43.33%，土壤微生物的分布还与气候、土壤物理性质等多种环境因素有关[33]。因此，还需要综合多种环境因素，关注土壤微生物在不同季节的变化情况。本研究得出的结论只能反映苏木山地区华北落叶松一代林随林龄和林分密度土壤肥力的变异规律以及土壤细菌和养分的相关关系，在未来的研究中还应探讨二代林是否会出现地力衰退的问题以及土壤酶活性和真菌对土壤养分的调控机制。

4 结论

1）随林龄增加，全磷和速效磷含量均呈上升趋势。不同林分密度的全氮、全碳、全钾、速效钾随林龄增加而变化趋势不同。不同林龄的华北落叶松人工林土壤肥力随林分密度变化的趋势不同，15 a 林分土壤肥力随密度增加先降低后升高，25 a 和37 a 林分随密度增加先升高后降低。

2）变形菌门、酸杆菌门和放线菌门是华北落叶松林的优势细菌门。随林龄增加，土壤优势细菌门相对丰度存在显著差异。变形菌门与全钾呈显著负相关；酸杆菌门与全氮存在显著正相关关系；放线菌门与全氮、全碳和全磷呈显著负相关，与pH 值呈显著正相关。随林龄增加，细菌丰富度和多样性升高；不同林龄林分的细菌丰富度和多样性指数随林分密度的变化与土壤肥力变化趋势相同。

3）不同林分发育阶段应维持适宜的林分密度，有利于维护土壤微生物多样性和土壤质量，以达到可持续经营的目的。