泥鳅表皮中活性成分提取工艺初步研究

肖 瑞，翁子依，段义君，糜志远，张 佳

(湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068)

泥鳅是一种传统的中药材，享有“水中人参”的美名[1]，具有非常高的药用以及食用价值[2]。《中华大词典》记述其分泌的黏液可以入药，具有味甘性平等特点[3-5]。现有研究显示，泥鳅中含有多糖[6]、凝集素[7-8]、超氧化物歧化酶[9-10]、抗菌肽[11-13]以及透明质酸[14]等多种药理活性成分。从泥鳅中分离出的多糖对人癌细胞系具有抗增殖以及凋亡等作用[15]，具有抗氧化增强免疫力等生理功能[16-18]。还有研究指出，泥鳅多糖对小鼠的免疫性肝损伤具有保护作用[19]。鉴于目前泥鳅活性物质的研究系统性、完整性不强，且尚不深入，本研究旨在从泥鳅表皮中活性物质的提取方法入手为泥鳅中活性物质的研究打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活泥鳅(购自武汉南湖综合生鲜市场)。

95%乙醇，无水乙醇，葡萄糖，考马斯亮蓝G-250，硫酸，苯酚，牛血清白蛋白。以上试剂均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产。

1.2 仪器与工具

TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂制造)；UV-2550型紫外分光光度计(日本岛津公司)；UPT-I-10T型超纯水仪(四川优普超纯科技有限公司)；BCD-232EJL/R小天鹅冰箱(江苏小天鹅营销有限责任公司)；BP121S 电子天平(德国赛多利斯集团公司)；0.1～5000μL移液枪(德国Eppendorf公司)；YB-2000A型粉碎机(永康市速锋工贸有限公司)；s6恒温水浴锅(常州市华怡仪器制造有限公司)；LGJ-50F真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵(郑州予华仪器制造有限公司)；PNG-9096A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；IG-50红外光谱仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。

1.3 泥鳅表皮活性物质的制备

1.3.1泥鳅表皮的制备将市售活泥鳅置清水中静养3～4 d，取出沥干，置-20℃冷柜中冷冻24 h后取出，切成3～4 cm长段，置真空冷冻干燥机中，-50℃下预冻20 h，-45℃～-5℃升华除水40 h，-5℃～20℃二次干燥10 h，取出粉碎，过20目筛，取泥鳅皮装袋备用。工艺流程见图1。

图1 泥鳅表皮的制备流程

1.3.2泥鳅表皮中活性物质的制备称取泥鳅皮适量，按料液比1∶20加入超纯水中，65℃提取2 h，冷却至室温，6000 r/min离心10 min，弃去沉淀，上清液加入10倍体积的95%乙醇，置冰箱中冷藏过夜，减压过滤，弃去滤液，所得固体用无水乙醇洗3次，30℃干燥，即得泥鳅表皮活性物质(类白色至淡黄色粉末，以下简称活性物质)。

2 单因素试验及结果

按上述制备方法，分别考察提取次数、提取温度、提取时间以及料液比等因素对活性物质提取率的影响。

2.1 单因素试验结果

2.1.1提取次数对活性物质得率的影响设定提取温度为65℃、提取时间2 h、料液比1∶20等条件不变，观察提取次数分别是1、2、3和4次时活性物质的得率(图2)。从图2可知，随着提取次数的增加，活性物质得率呈现先增加后降低的趋势，在提取次数为3次时最大，因此提取次数初步确定为3次。

图2 提取次数对活性物质得率的影响

2.1.2提取温度对活性物质得率的影响设定提取次数为3次、提取时间2 h、料液比1∶20等条件不变，观察提取温度分别是45℃、55℃、65℃和75℃时活性物质的得率(图3)。从图3可知，随着提取温度的增加，活性物质的得率呈现先增加后降低的趋势，在提取温度为65℃时有最大得率，因此提取温度初步确定为65℃。

图3 提取温度对活性物质得率的影响

2.1.3提取时间对活性物质得率的影响设定提取次数为3次、提取温度65℃、料液比1∶20等条件不变，观察提取时间分别是1、2、3和4 h时活性物质的得率(图4)。从图4可知，随着提取时间增加，活性物质得率呈现先增加后降低的趋势，在提取时间为2 h时最大，因此提取时间初步确定为2 h。

图4 提取时间对活性物质得率的影响

2.1.4料液比对活性物质得率的影响设定提取次数为3次、提取温度65℃、提取时间2 h等条件不变，观察料液比分别是1∶10、1∶20、1∶30和1∶40时活性物质的得率，结果见图5。从图5可知，随着料液比的增加，活性物质的得率呈现先增加后降低的趋势，在料液比为1∶20时有最大得率，因此料液比初步确定为1∶20。

图5 料液比对活性物质得率的影响

3 正交试验及结果

3.1 正交试验优化设计

在单因素试验的基础上，选择提取次数、提取温度、提取时间以及料液比等因素，以活性物质得率为指标进行五因素四水平正交试验(表1)。

表1 正交试验因素水平设计

3.2 正交试验结果

分别从浸提次数、提取温度、提取时间以及料液比等方面对泥鳅活性粗提物得率进行正交试验优化设计。正交试验结果如表2所示。

表2 正交试验结果

由表2可见泥鳅活性粗提物得率受影响的4个因素中，浸提次数最为显著，其他三个因素依次为提取温度、提取时间和料液比。最终试验结果表明：泥鳅活性物质粗提最优方法是A3B3C2D2，即浸提次数3次、提取温度65℃、提取时间2 h、料液比为1∶20，这个结果与单因素试验结果基本一致。

4 泥鳅表皮活性物质中蛋白质和多糖的含量测定

4.1 多糖含量的测定

采用硫酸-苯酚法测定泥鳅表皮活性物质中多糖的含量。

4.1.1线性范围精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，置100 mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶，定容，分别取上述溶液各1.0 mL置刻度试管中，各加入5%苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL，混匀放置，待其冷却至室温，在波长490 nm处，测其吸光度，绘制A-C曲线。

4.1.2样品测定精密称取泥鳅活性物质10 mg置100 mL容量瓶中，加超纯水溶解过滤，取滤液1.0 mL至刻度试管中，加入5%苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL，混匀放置，冷却至室温，在波长490 nm处，重复测定三次该样品溶液的吸光度，取平均值代入上述标准曲线中，计算多糖含量。

4.2 多糖含量的测定结果

按上述方法得到葡萄糖线性范围(图6)。在浓度0.01～0.05 mg/mL范围内，葡萄糖浓度和吸光度呈良好线性，线性方程为y=12.52x+0.0682，R2=0.9994。样品在490 nm处的吸光度测定结果见表3，吸光度测定的平均值为0.383，代入葡萄糖标准曲线得泥鳅活性物质中多糖含量为0.025 mg/mL，即25%。

图6 葡萄糖标准曲线

表3 样品的紫外吸收测定结果(490nm)

4.3 泥鳅表皮活性物质中蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法测定泥鳅表皮中活性物质中蛋白质的含量。

4.3.1线性范围精密称取牛血清白蛋白25 mg，置25 mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，精密吸取1、2.5、3.5、4.5和5.5 mL，分别置于10 mL容量瓶，定容，分别取上述溶液各0.1 mL置刻度试管中，各加入0.9 mL超纯水、考马斯亮蓝G-250试剂5 mL，混匀放置，在波长595 nm处，测其吸光度，绘制A-C曲线。

4.3.2样品测定精密称取泥鳅活性物质100 mg置10 mL容量瓶中，加超纯水溶解过滤，取滤液0.1 mL至刻度试管中，加入超纯水 0.9 mL、考马斯亮蓝G-250试剂5 mL，混匀放置，在波长595 nm处，重复测定3次该样品溶液的吸光度，取平均值代入上述标准曲线中，计算蛋白质含量。

4.4 蛋白质含量的测定结果

对泥鳅活性物质中蛋白质含量进行测定，蛋白质标准曲线见图7。在浓度0.15～0.55 mg/mL范围内，蛋白质浓度和吸光度呈良好线性，标准曲线方程为y=2.613x-0.2446，R2=0.9996。样品在595 nm下吸光度测定结果见表4，吸光度平均值为0.149，代入蛋白质标准曲线，得泥鳅活性物质中蛋白质含量为0.15 mg/mL，即15%。

图7 蛋白质标准曲线

表4 样品的紫外吸收测定结果(595nm)

5 泥鳅活性物质的红外图谱

取适量泥鳅活性物质，测定其红外光谱(KBr压片法)，结果见图8。由谱图可知，3699 cm-1处应为N-H伸缩振动吸收峰(υN-H), 3304 cm-1为O-H伸缩振动吸收峰(υO-H), 2925 cm-1处中等强度的峰应为饱和碳氢的伸缩振动吸收(υC-H), 2854 cm-1处为氨基酸分子中NH3+(偶极离子)的特征吸收，羰基伸缩振动吸收(υC=O)则出现在1746 cm-1处，1659 cm-1应为羧酸根负离子的特征吸收(υCOO-), 1455 cm-1处应为饱和碳氢的弯曲振动吸收峰(δC-H)。综上所述，本品既含有多糖的特征吸收(如较强的饱和碳氢吸收，标明应含有大量的饱和碳氢键，以及羟基的存在，均符合多糖的特征)，也有明显的蛋白质分子的结构特征，如NH3+(偶极离子)和与之对应的COO-(羧酸根负离子)均显示为氨基酸的特征吸收；羰基的存在，也印证了这个结论。因此，红外分析结果和化学分析结果基本一致，证明本品中的主要成分应为多糖和蛋白质。

图8 泥鳅活性物质的红外图谱(FT-IR Spectrum)

6 讨论与结论

活性物质可能会随泥鳅加工而遭到破坏，故采用冷冻干燥法，将其活性物质有效保存。由于泥鳅表皮特性柔软，在粉碎过程中能较好地与其他组织(肌肉等)分离，而其表面的黏液等则可以固化在表皮表面，故采用65℃提取，以尽量保持活性物质的稳定。

1)单因素试验、正交试验结果显示，泥鳅表皮活性物质提取最佳条件为：提取次数3次、提取温度65℃、提取时间2 h、料液比1∶20。其提取率为8.52%。

2)泥鳅表皮活性物质主要为多糖(含量为25%)，蛋白质含量较低(含量为15%)。红外图谱表明，本品的主要构成应为氨基酸和多糖。

3)采用硫酸苯酚法测定泥鳅活性物质中的多糖含量，考马斯亮蓝法测定泥鳅活性物质中的蛋白质含量，测定方法操作简便，结果准确，便于实际应用。

在下一步的研究中，会将蛋白质和多糖进行分离，对多糖进行进一步的鉴定，并比较泥鳅表皮中的蛋白质是否和肌肉组织中的蛋白质同源，为泥鳅中活性物质的研究提供进一步的证据。