lncRNA⁃DINO靶向miR⁃141调控Keap1⁃Nrf2通路促进非小细胞肺癌化疗耐药的机制研究

夏瑶，徐蕾，唐志贤，谢春发，朱慎钰*

目前，肺癌的发病率和病死率均居各种肿瘤之首［1，2］。肺癌的主要病理类型包括非小细胞肺癌（non⁃smal1 cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌两大类，其中非小细胞肺癌占肺癌总数的85%左右，多数患者确诊时已为晚期，5年生存率极低［3］。化疗是晚期非小细胞肺癌全身治疗的主要手段，但是在治疗过程中，常常出现NSCLC细胞对多种化疗药物的抵抗，即化疗耐药［4］。因此，非小细胞肺癌的化疗耐药，成为治疗失败的主要原因和临床医生面临的重大挑战。长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）曾经被认为是基因中没有功能的部分，但近年的研究发现，ln⁃cRNA可在多个水平参与基因表达调控，影响生长发育、细胞增殖、分化、代谢和凋亡等［5］。lncRNA的异常表达与肿瘤的发生、发展、侵袭及转移密切相关［6］。由于人类细胞中lncRNA种类众多、数量庞大，目前对lncRNA功能的研究还远远不够［7］。了解lncRNA在非小细胞肺癌耐药中的作用，并探索以其为调控靶点，意义重大。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2020年1月至2020年6月在赣南医学院第一附属医院心胸外科进行化疗的NSCLC患者。对初治、化疗敏感的NSCLC患者行肿瘤组织活检，活检后立即液氮保存。纳入标准：均属于原发性NSCLC患者；均对初治、化疗敏感的NSCLC患者。排除标准：继发性肺癌患者；合并有其他癌症患者；对初治、化疗不敏感的NSCLC患者；凝血功能异常或有出血倾向者。本研究已通过医院伦理委员会审核批准；患者及家属均对本研究知情同意，并自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 RT⁃PCR，Western⁃blot技术对比检测A549与A549/DDP差异将A549细胞株和A549/DDP细胞株进行细胞培养，使用Trizol（Invitrogen公司）法提取总RNA，用lncRNA芯片对比检测两组细胞株间LncRNA的表达差异。通过在线软件（RNAhy⁃brid）预测和计算。将A549细胞株和A549/DDP细胞株进行细胞培养，使用Trizol（Invitrogen公司）法提取总RNA，RT⁃PCR验证两组细胞株间DINO、miR⁃141、Keap1、Nrf2、HO⁃1、NQO1。提取A549细胞株和A549/DDP细胞株的蛋白，采用Western⁃blot技术检测Keap1、Nrf2、HO⁃1、NQO1蛋白表达水平。

1.2.2 构建慢病毒表达载体上调、下调目的基因设计有效干扰DINO的序列，构建低表达DINO慢病毒表达载体、过表达DINO慢病毒表达载体，转染A549细胞株得到低表达DINO细胞株（A549⁃siDINO）、过表达DINO细胞株（A549⁃DINO），采用RT⁃PCR检测DINO、miR⁃141、Keap1、Nrf2、HO⁃1、NQO1表达，Western⁃blot技术检测Keap1、Nrf2、HO⁃1、NQO1的蛋白表达水平，MTT法检测细胞对化疗药物敏感性的改变。构建低表达miR⁃141慢病毒表达载体、过表达miR⁃141慢病毒表达载体，转染A549细胞株得到低表达miR⁃141细胞株（A549⁃simiR⁃141）、过表达miR⁃141细胞（A549⁃miR⁃141），采用RT⁃PCR检测miR⁃141、Keap1、Nrf2、HO⁃1、NQO1表达，Western⁃blot技术检测Keap1、Nrf2、HO⁃1、NQO1的蛋白表达水平。

1.3 统计学处理

对所有统计资料采用SPSS 13.0软件包进行统计分析：计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验或方差分析，率的比较采用χ2检验，使用析因方差分析数据相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA DINO与肺腺癌细胞株顺铂敏感性

将对顺铂耐药的肺腺癌细胞株A549/DDP与敏感的肺腺癌细胞株A549对比，提取总RNA进行lncRNA的芯片检测。结果发现，A549/DDP与A549细胞相比，399个lncRNA发生2倍以上的变化（156个下调，243个上调）。其中下调显著lncRNA中，包括新的lncRNA DINO，见图1A。RT⁃PCR对比检测腺癌耐药株A549/DDP与敏感株A549中DINO的表达差异显示，与肺癌敏感株A549相比，DINO在耐药株A549/DDP中表达显著降低（P<0.05），见图1B。

图1 顺铂耐药的肺腺癌细胞株lncRNA DINO表达水平下降

2.2 A549与A549⁃DINO细胞对顺铂的敏感性及miR⁃141与DINO的结合

合成DINO基因并克隆于逆转录病毒表达载体中，包装病毒后感染A549细胞，建立稳定过表达DINO的A549细胞株，命名为A549⁃DINO。MTT法对比检测A549与A549⁃DINO细胞对顺铂的敏感性差异。结果显示A549⁃DINO细胞对化疗药物顺铂的敏感性增高，耐药性降低（P<0.05），见图2A。通过在线软件预测和计算，发现DINO与miR⁃200a，miR⁃141，miR⁃200b等均可能结合，其中与miR⁃141的结合可能性最高。miR⁃141与DINO的配对位点和结合的二级结构，见图2B。

图2 A549⁃DINO细胞对顺铂敏感性增高；DINO与miR⁃141的结合可能性最高

2.3 miR⁃141、miR⁃200a、miR⁃200b、miR⁃200c、miR⁃429的表达

RT⁃PCR对比检测A549、A549/DDP中miR⁃141、miR⁃200a、miR⁃200b、miR⁃200c、miR⁃429的表达，发现A549/DDP中miR⁃141和miR⁃200c的表达明显升高，其中miR⁃141的升高更为显著，而其他microRNA的表达变化不明显（P<0.05），见图3A。在稳定过表达DINO的A549⁃DINO细胞和A549细胞中，RT⁃PCR对比检测miR⁃141、miR⁃200a、miR⁃200b、miR⁃200c、miR⁃42的表达，发现过表达DINO后miR⁃141表达下降，而其他microRNA的表达变化不明显。结果提示DINO可能是通过调控miR⁃141表达发挥作用的，见图3B。

图3 过表达DINO的A549⁃DINO胞中miR⁃141表达下降

2.4 A549、A549⁃DINO及A549⁃miR⁃141细胞中基因的表达差异

RT⁃PCR对比检测A549细胞和过表达DINO的A549⁃DINO细胞中，miR⁃141、Keap1、Nrf2、HO⁃1和NQO1的表达差异。结果证明过表达DINO后，miR⁃141表达下降，Keap1表达上调，Nrf2、HO⁃1和NQO1表达下调（P<0.05）。该结果证明DINO调控miR⁃141，进而调控Keap1⁃Nrf2通路的可能性，见图4A。将miR⁃141克隆入表达载体，转染A549细胞以过表达miR⁃141，命名A549⁃miR⁃141。而后RT⁃PCR对比检测A549和A549⁃miR⁃141细胞中Keap1、PTEN、MSH2等其可能靶基因的表达差异。结果发现，过表达miR⁃141后，Keap1基因表达明显下降，而其他基因表达无明显变化（P<0.05）。提示miR⁃141可能是通过调控Keap1基因的表达而发挥作用的，见图4B。

图4 A549⁃miR⁃141细胞中Keap1基因表达明显下降

2.5 Keap1、Nrf2和其下游基因HO⁃1、NQO1的表达差异

RT⁃PCR对比检测A549和A549⁃miR⁃141细胞中Keap1、Nrf2和其下游基因HO⁃1、NQO1的表达。结果证明过表达miR⁃141后，Keap1基因的表达下调，而Nrf2和其下游基因HO⁃1、NQO1表达上调（P<0.05），见图5A。Western⁃blot检测A549和A549⁃miR⁃141细胞中Keap1、Nrf2和其下游基因HO⁃1、NQO1蛋白表达水平，见图5B。

图5 过表达miR⁃141的A549⁃miR⁃141细胞中Keap1表达下调

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，肺癌发病率和病死率是癌症中增长最快的［8，9］。化疗是晚期非小细胞肺癌全身治疗的主要手段，在治疗过程中，经常出现对多种化疗药物的耐药。但DINO与肿瘤耐药的关系目前尚无研究报道。为了深入研究DINO对NSCLC化疗耐药的作用，在该研究中以RT⁃PCR法检测DINO表达，证实DINO在耐药细胞株中表达明显降低。Chang等学者［10］在Nature Genetics报道，DNA损伤可诱导CDKN1A基因上游转录出一长链非编码RNA，命名为DINO（damage induced noncoding），在人类细胞DNA受损伤时，DINO表达上调，并通过结合和稳定p53蛋白而促进损伤修复通路或细胞凋亡。进一步研究发现，通过合成、克隆和转染，在A549细胞中过表达DINO后，细胞对顺铂的敏感性显著提高。因此，我们推测，DINO的表达降低，可能促进了非小细胞肺癌的耐药。进一步实验证明，耐药的NSCLC细胞株中DINO表达较敏感细胞显著降低，过表达DINO使肿瘤细胞对化疗的敏感性增加。

lncRNA调控基因表达的机制中，最常见的是竞争性结合某些miRNA，成为miRNA的“吸附海绵”，从而调节游离miRNA的含量，进而影响靶基因的表达［11］。前期实验结果显示，DINO是通过与miR⁃141结合而发挥作用的。miRNA⁃141是miR⁃NA⁃200家族的一员，该家族由于与肿瘤的EMT和转移密切相关而“知名”［12，13］。miRNA⁃141与肿瘤的耐药关系，目前只有少数研究报道［14，15］。为进一步研究，对miRNA⁃141进行了生物信息学预测分析，发现过表达miR⁃141导致NSCLC细胞中Keap1（kelch like ECH associated protein 1）基因表达明显下降（P<0.05），而PTEN和MSH2的表达无明显改变。

Keap1是Nrf2，即人类NF⁃E2相关因子2（nu⁃clear factor E2⁃related fator 2）的胞质结合蛋白，Keapl⁃Nrf2信号通路在抗氧化应激过程中起重要作用［16］。在氧化应激等情况下，Keapl蛋白发生结构改变，引起Keapl和Nrf2解离，Nrf2激活入核，启动抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）调控的Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶等基因表达，增加细胞对氧化应激的抗性［17］。Keapl⁃Nrf2通路在保护细胞免受自由基损伤、防止细胞凋亡方面有着十分重要的意义［18］。最新的研究发现，肿瘤细胞在接受顺铂等化疗药物治疗时，细胞中ROS水平升高，可以促进DNA断裂等损伤，导致肿瘤细胞的死亡。而肿瘤细胞内游离Nrf2若上调，可激活ARE，促进抗氧化酶等基因表达，加速细胞内ROS的清除，可提高肿瘤细胞对化疗药物的耐受性，促进肿瘤细胞的耐药［19，20］。我们进一步研究发现在A549细胞株中过表达miR⁃141后，Keap1基因的表达下调，而Nrf2和其下游基因HO⁃1、NQO1表达上调。

实验结果显示，miR⁃141可能通过靶向Keap1基因而调控Keap1⁃Nrf2通路。RT⁃PCR对比检测发现，与A549细胞相比，过表达miR⁃141的A549⁃miR⁃141细胞中Keap1基因表达明显下降（P<0.05），而PTEN和MSH2表 达无 明 显变 化。RT⁃PCR对比检测显示，与A549细胞相比，A549⁃miR⁃141细胞中Keap1基因的表达下调，而Nrf2基因和其下游HO⁃1、NQO1基因表达显著上调（P<0.05）。正常情况下，Nrf2与Keapl结合被抑制，并与肌动蛋白结合被锚定在细胞浆中。在氧化应激等情况下，Keapl蛋白发生结构改变，引起Keapl和Nrf2解离，Nrf2激活入核，启动抗氧化反应元件ARE调控的基因表达。

综上所述，本研究表明非小细胞肺癌中ln⁃cRNA⁃DINO可靶向结合miR⁃141，进而调控Keap1⁃Nrf2通路而导致细胞的化疗耐药。即DINO低表达导致细胞内miR⁃141丰度升高，引起Keap1基因表达下调，从而促进细胞浆内Nrf2入核增加，激活其下游基因群的表达，从而促进肿瘤化疗耐药。阐明DINO在非小细胞肺癌化疗耐药中的作用机制，并为以DINO和miR⁃141为靶标设计逆转耐药策略提供科学依据。