东莞某屠宰场猪链球菌检测及分离鉴定

黄 元，陈锦良，黄育浩，张端秀，王晓虎，杨德胜，王 刚，向 华

（1.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东 广州 510640；2.东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 523128）

【研究意义】猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是影响断奶后仔猪最重要的细菌性猪病原体之一，主要引起脑膜炎、关节炎和猝死。在一些国家该菌仍然是一种重要的人畜共患病病原体［1］。该菌不仅会造成严重的经济损失，还会引起有关动物福利和抗菌素耐药性的担忧。根据荚膜多糖（Capsule polysacharides）抗原的差异，猪链球菌共分为多种血清型［2-3］，其中猪链球菌2 型（SS2）致病力最强，不但引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎甚至死亡，也可导致人的感染和死亡。因此，对猪链球菌进行流行病学调查分析具有重大的公共卫生意义。

【前人研究进展】2005 年我国四川省暴发人感染猪链球菌病疫情，报告204 例，死亡38 例，引起了公共卫生和科学研究领域的极大关注［4］。近几年来SS2 感染人的病例也有报道，呈散发状态［5-8］。无防护措施下经常直接接触猪及其副产品是导致人感染猪链球菌病的主要感染方式。其中，屠宰场是最可能发生感染猪链球菌的场所［9-10］。

Vishva等［11］采集563 头表面健康的屠宰猪的腭扁桃体，在分离的87 个猪链球菌分离株中检测到 6 种血清型，显示SS7（24.13%）和SS5（18.39%）为优势血清型，而在扁桃体 DNA 中检测到11 种血清型，其中SS9（28.26%）和SS7（14.13%）为主要血清型。近年来，我国有学者对江苏、河南、黑龙江、宁夏、广东等地［12-13］屠宰场的猪链球菌携带状况进行调查。2007—2009 年东莞市各镇街屠宰场的屠宰猪经采样进行荧光定量PCR 检测，结果显示，2007 年未出现SS2 感染猪，2008、2009 年SS2 检出率分别为37.4%和74.85%［9］。2015 年从东莞市各镇街屠宰场采集猪扁桃体样品共320 份及环境样品252 份，分离出溶血性链球菌276 株，检出率为41.1%［10］。

【本研究切入点】2021 年6 月，佛山市某屠宰猪相关人员在东莞市某屠宰场从事屠宰活动后感染SS2 死亡。屠宰场作为SS2 病原的来源地，其公共卫生问题再次引起关注。目前东莞屠宰场的猪链球菌特别是SS2 流行情况如何，需要更多的调查数据，以进一步评估人感染猪链球菌的风险。【拟解决的关键问题】2021 年7 月初，在东莞该屠宰场进行采样和猪链球菌分离鉴定，以期调查猪链球菌特别是SS2 在屠宰场健康猪群中的携带情况和抗生素耐药情况，对该菌的传播风险进行评估，为其防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 2021 年7 月8 日在东莞某屠宰场，用经灭菌的剪刀、镊子、注射器进行无菌操作，采集40 头猪的关节液和扁桃体，共获得80份样品。40 头猪分别来源于广东、广西、湖南和江西四省（区）九市的12 个养殖场。

1.1.2 主要试剂 细菌基因组DNA 提取试剂盒GeneJET Genomic DNA Purification Kit 为Thermofisher产品，PCR 相关酶和试剂为TaKaRa 产品，血琼脂平板和TSB 平板为广州环凯微生物科技有限公司产品。其他试剂和耗材等购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离 将样品分别接种于血琼脂平板上，37 ℃倒置培养约24 h 后，观察菌落大小和形态，对典型单菌落在TSB 平板上划线纯化。

1.2.2 样品的PCR 检测 对关节液和扁桃体样品分别加适量PBS 研磨，用试剂盒提取细菌基因组DNA，对SS 的特异性基因recN［14］和SS2 的特异性基因cps2J［15］分别进行PCR 检测，SS2 阳性样品用引物cpsK-F 和cpsK-R2［16］进行 PCR验证，扩增产物测序并进行序列分析。引物序列和扩增条件见表1。

1.2.3 分离菌的PCR 鉴定（1）16S rDNA的PCR 鉴定。对划线分离的疑似链球菌用针对16S rDNA 的引物［17］进行PCR 扩增及测序鉴定。通过16S rDNA 片段的序列比对，确定所分离细菌的种属，引物序列和扩增条件见表1。（2）SS 分型PCR 鉴定。单菌落用TSB 培养基振荡培养过夜后，用试剂盒提取细菌基因组DNA，分别用针对33 种不同血清型的34 对SS 特异性基因片段进行PCR 扩增，以确定SS 的血清型，PCR 引物和扩增条件按照文献［15,18］进行，部分引物信息见表1。

表1 供试PCR 引物Table 1 PCR primers for the test

1.2.4 毒力基因的PCR 鉴定 采用分离到的SS基因组DNA，针对不同毒力基因进行PCR 扩增，以确定毒力基因在分离菌中的携带情况。PCR 引物和扩增条件按照文献［18-19］进行，引物信息见表1。

1.2.5 抗生素敏感性试验 采用纸片琼脂扩散法［20］检测分离菌株的敏感性，取恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素、阿莫西林、青霉素G 等16种药物的药敏片贴于涂布菌液的TSA 培养基表面，37 ℃培养18 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，平行试验3 次，计算平均值，根据美国临床实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的抗生素药敏试验判定标准（2019 版），评估受试菌的药物敏感性。质控菌株为变异链球菌（Streptococcus mutans,ATCC25175）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC26003）。

2 结果与分析

2.1 样品的PCR 检测

对采集的40 份关节液和40 份扁桃体样品提取细菌基因组DNA，对SS 特异性基因recN和SS2 特异性基因cps2J分别进行PCR 检测，结果（表2）表明，在40 份关节液样品中，有9 份呈SS 阳性、阳性率为22.5%，未发现SS2 阳性；在40 份扁桃体样品中，有13 份呈SS 阳性、阳性率为32.5%，其中3 份呈SS2 阳性、阳性率为7.5%。

表2 组织样品的PCR 检测结果Table 2 PCR detection results of tissue samples

对3 份SS2 阳性样品的cps2J片段和cpsK片段扩增产物进行测序，cps2J片段核苷酸序列经比对可知，3 株SS2 之间相应序列同源性为100%；在NCBI 进行在线BLAST 分析可知，3 株SS2的cps2J基因片段与荷兰报道SS2的cps2J基因（AF118389）相应片段的同源性最高（99.6%）。对所获得的cpsK片段核苷酸序列进行比对可知，3 株SS2 之间相应序列同源性为100%；产物长度为486 bp，在cpsK基因483 bp 对应位置为SS2特征性的核苷酸G［16］，产生BstNI 酶切位点，与预期相符。据此可以确定这3 份样品中含有SS2。

对样品来源信息追查发现，3 份SS2 阳性样品均来自湖南同一养猪场。对照采样记录可知，3份样品对应的猪在关节处均有一定程度的肿胀。

2.2 SS 分离和PCR 鉴定结果

从供试40 头猪的扁桃体和关节液得到6 份形态疑似链球菌的菌落，菌落呈白色圆形，血平板上菌落周围形成溶血环（图1），革兰氏染色呈阳性，在显微镜下均呈链状或双球状（图2）。

图1 血平板上分离菌的生长形态Fig.1 Colonial morphology of the isolated strains on blood plate

对这6 份疑似链球菌的16S rDNA 进行PCR扩增（图3）和测序，经核苷酸序列在线BLAST比对分析表明，编号为20、28 和39 号的3 株菌（分别命名为GD20、GD28 和GD39）的16S rDNA序列均与SS 序列同源性最高。其中，与GD20和GD28 测序序列同源性最高（均为99.47%）的是日本分离的SS 菌株MO869（GenBank 登录号：LC377186）；与GD39 测序序列同源性最高（99.57%）的是日本分离的SS 菌株DTK399（GenBank 登录号：LC316884）。对SS 特异性基因recN的PCR 扩增表明，GD20、GD28 和GD39均为阳性。因此将菌株GD20、GD28 和GD39 认定为猪链球菌。

图3 SS 特异性基因recN 的PCR 扩增Fig.3 PCR amplification to specific gene recN of SS

2.3 猪链球菌分型鉴定结果

3 株SS 的分型鉴定结果表明，菌株GD28 基因组DNA 用针对SS4的cps4K基因引物扩增，可得到特异性片段（图4），可确定为SS4；菌株GD20 和DG39 基因组DNA 用针对SS9的cps9H基因引物扩增，可得到特异性片段（图5），可确定为SS9。

图4 SS4 特异性基因cps4K 的PCR 扩增结果Fig.4 PCR amplification to specific gene cps4K of SS4

图5 SS9 特异性基因cps9H 的PCR 扩增结果Fig.5 PCR amplification to specific gene cps9H of SS9

2.4 毒力基因鉴定结果

3 株SS 毒力基因的PCR 鉴定结果如表3 所示。多个毒力基因检测为阳性，表明这3 株SS 具有一定的致病性。

表3 毒力基因的PCR 鉴定结果Table 3 PCR identification of virulence gene

2.5 药敏试验结果

药敏试验结果（表4）表明，3 株SS 分离株对青霉素G、林可霉素、多粘菌素B 和磺胺异恶唑均表现耐药，对恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素和阿莫西林均较敏感。质控菌株药敏试验结果符合预期。

表4 药敏试验结果Table 4 Results of drug sensitivity test

3 讨论

近年来，屠宰场的卫生安全问题受到关注［21］。屠宰场是猪链球菌病防控的重要场所，无防护措施下屠宰、分割、洗切是高风险行为［9-10］。对广州市2016—2021 年75 例人感染猪链球菌病流行特征分析表明，来自屠宰场或从事猪肉零售相关工作的病例占24%，职业和生活上接触表面健康猪只、市售猪肉史且未采取防护措施的病例占56%，暴露时手部有伤口的病例占28.57%；SS 的血清型以2 型 SS2 为主［22］。

SS2 在一年四季均可发生，但对人的感染在夏季发生较多。研究表明，夏秋季表面健康猪SS2 检出率高于冬春季节，SS2 感染人的病例在夏季多发，原因可能与本季节猪携带SS 的优势致病血清2 型菌高于冬春季有关［13］。本研究于2021年夏季在发生人感染SS2 的屠宰场进行SS 流行病学调查，具有很强的针对性。

本研究采样的屠宰猪，除了少量猪只关节处有轻微肿胀外，其余均呈外观健康。对40 头猪的关节炎和扁桃体进行PCR 检测，结果显示关节液中SS 阳性率为22.5%，SS2 阳性率为0%；扁桃体样品中SS 阳性率为32.5%，SS2 阳性率为7.5%。多份扁桃体中检测出SS2 核酸，提示存在SS2 感染人的风险。近几年我国学者对屠宰场生猪进行一系列流行病学调查，扁桃体SS 核酸检测阳性率为9.27%～65%不等［13,23-25］。2017 年对在广东地区养殖场采集的发病猪群样品及健康猪群样品进行SS 携带情况调查，结果表明，发病猪群SS的阳性率为82.02%（187/228），健康猪群的SS阳性率为42.20%（192/455），其中屠宰场屠宰猪群的SS 阳性率为32.10%（78/243）［24］。2021年于重庆屠宰场共采集表观健康猪扁桃体154 份，检出SS 阳性样本80 份（51.95%），从中分离到菌株87 株；主要血清型分别为SS16（16.09%）、SS9（9.20%）、SS4（8.05%），而SS2 占比4.60%［25］。与2010 年和2015 年在东莞屠宰场的SS 调查［9-10］相比，本研究对SS 的核酸检出率和菌株分离率均相对较低，可能与该屠宰场在发生人感染SS2 后加强消毒和检疫有关。扁桃体是SS 入侵猪体内首先定植的部位［26］，健康猪可在扁桃体中携带SS，成为该菌在猪群中传播的传染源，从正常屠宰猪扁桃体中可分离到致病性SS。Vishva等［11］对表面健康的屠宰猪腭扁桃体检测表明，SS 抗原免疫检测的组织病理学变化证实其在无症状携带者中持续存在，部分菌株对小鼠表现显著致病性。本研究中SS 在扁桃体中的阳性率远大于关节液中的阳性率，其中SS2 在扁桃体中阳性率为7.5%，而在对应的关节液中均未检出阳性，提示SS 在猪体内处于所谓的携带状态，即在扁桃体中存在，未表现症状而不容易发现感染，这对SS 防控造成一定困难。本研究检出的3 份SS2 阳性样品均来自扁桃体组织，且均来自于同一养殖场，提示SS2 在该养殖场的猪群中已有一定程度传播，尚未在屠宰场造成传播。本研究在采样过程中采取无菌操作，然而由于扁桃体是开放器官，因此也不能排除外界环境SS 造成扁桃体污染的可能性。

根据荚膜多糖抗原的差异，SS 可分为29 种传统血清型和Chz 血清型。此外，根据荚膜基因簇的差异，近年来发现27 种新的荚膜基因簇菌株［3］。目前发现可感染人的血清型已达10 种。本研究对关节液和扁桃体进行SS 分离，从关节液中分离出3 株SS，其中1 株鉴定为SS4，另两株为SS9。SS9 和SS4 均曾造成人的感染［27-28］，在防疫中不可忽视。

目前一般根据毒力标志基因的分布判断SS毒力。溶菌酶释放蛋白MRP 又称为M 蛋白，一般认为与SS 的吸附能力有关；mrp和epf被认为编码SS 的2 种重要毒力因子，与SS 的致病性密切相关［2］。甘油醛-3-磷酸脱氢酶GADPH 一般存在于细胞浆中，研究表明，随着gadph基因表达量的增加，SS 毒力也随之增加［29］。orf2基因作为一种毒力因子在猪源链球菌中普遍存在。gdh基因是链球菌的保守的毒力因子，可作为链球菌的定属鉴定［30］，但不能用于鉴定SS［18］。一般认为epf+mrp+sly+的SS2 菌株是强毒株［29］，但对其他血清型的强毒株认定尚无定论。对印度健康屠宰猪的调查中，arcA+sly+epf+mrp-为普遍的基因型。对广州周边地区健康猪群SS 携带情况的调查中，68 株健康猪分离的SS 中，有61 株全为epf-mrp-sly-，1株为epf-mrp+sly-，6株为epf-mrp-sly+［31-34］。本研究对SS 毒力基因的PCR 鉴定表明，分离的SS4 菌株基因型为epf-mrp+gdh+gapdh+fbps-orf2+sly-，分离的2 株SS9 菌株基因型分别为epf-mrp+gdh+gapdh+fbpsorf2+sly-和epf-mrp-gdh+gapdh+fbps-orf2+sly+。这提示3 株SS 可能具有一定的致病性。在采样时对20、28 和39 号猪的观察中发现，猪下肢关节均有一定程度肿胀，提示这3 株SS 均已经造成了关节炎症，其致病性不容忽视。

药敏试验结果提示，分离的3 株SS 对多种抗生素耐药。在对猪SS 的防控方面，养殖场应当控制抗生素使用，根据药敏试验结果有针对性地选择抗生素，不可采取长期使用广谱抗生素的办法。

4 结论

对东莞某屠宰场外表健康屠宰猪样品进行猪链球菌PCR 检测，关节液中猪链球菌阳性率为22.5%（9/40）；扁桃体样品中，猪链球菌阳性率为32.5%（13/40），其中SS2 阳性率为7.5%（3/40）。对样品进行猪链球菌分离、形态鉴定和PCR 鉴定，获得 1 株SS4 和2 株SS9。对毒力基因的PCR 鉴定提示，这3 株猪链球菌具有一定的致病性。药敏试验表明，3 株猪链球菌对青霉素G、林可霉素、多粘菌素B 和磺胺异恶唑耐药，对恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素和阿莫西林敏感。研究表明，该屠宰场猪群中存在猪链球菌的隐性感染，也提示存在SS2 感染人的风险。