甘油致不同性别SD大鼠急性肾脏损伤模型的评价

张华允，于志强，阳志禹，马中春

(宁波海关技术中心/宁波中盛产品检测有限公司，浙江 宁波 315012)

甘油肌肉注射诱导的肾损伤作为最常用的急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)模型被广泛应用于各项研究中[1-3]。高渗性的甘油溶液能够造成注射部位肌肉组织的变性坏死并且可造成局部组织的红细胞溶解，使机体产生肌红蛋白尿，其特征是急性肾小管坏死和肾皮质炎性细胞浸润[4]。

本研究采用肌肉注射甘油制备急性肾损伤模型，并观察甘油对不同性别大鼠生化、血常规、尿常规、血凝及肾、肝、脾等脏器的病理变化。探讨在肌肉注射甘油制备急性肾损伤模型中的性别差异及其他脏器的损伤程度，为建立和完善甘油致SD大鼠急性肾脏损伤模型积累相关研究资料。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠24只，体质量(200±20)g，由杭州医学院提供，生产许可证号SCXK(沪)2019-0002，实验动物使用许可证号SYXK(浙)2018-0003。屏障环境适应性饲养一周后进行试验，实验室温度控制在20～24℃，相对湿度控制在40%～70%。

1.2 试剂及配制

甘油、生理盐水及病理检查试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。根据文献进行50%甘油生理盐水的配制[5]。取25 mL甘油与25 mL生理盐水混合后混匀，现配现用。

1.3 主要仪器

电子天平购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，ST 16R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)，AU480全自动生化分析系统(贝克曼库尔特商贸中国有限公司)，XT-1800i全自动血液分析仪(希森美康医用电子上海有限公司)，AX-4030尿液分析仪(日本爱科来公司)，CA-1500血液凝固测定仪(威士达医疗器械上海有限公司)，CKX53显微镜(日本Olympus公司)，实验动物安乐死仪(上海至远生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

试验前禁水24 h，大鼠两侧后肢肌肉剃毛消毒后，试验组按10 mL/kg[6]注射50%甘油生理盐水，对照组注射等量的生理盐水，24 h内自由进食与饮水。试验24 h后，放置于代谢笼中，禁食不禁水，并开始收集24 h尿液。试验后48 h后安乐死动物，采血管收集腹主动脉血液并采集肝、肾、脾等器官。进行血生化(总蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮、谷丙转氨酶、门冬氨酸氨基转移酶)，血常规(白细胞、红细胞、血小板)，尿常规(酮体、潜血、尿蛋白、尿比重、尿酸碱性)，血凝(凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间)指标检测及组织病理制片观察。

1.5 统计学分析

采用SPSS 26.0进行数据处理，计算平均值及方差，各组间比较采用单因素方差分析和t检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 血清生化指标

血清生化指标检测结果见表1，可见与同性别对照组比较，甘油试验组动物白蛋白(ALB)数值明显降低，肌酐(Crea)、尿素氮(Urea)、谷丙转氨酶(ALT)数值明显升高(P＜0.05)；雌性甘油试验组动物的总蛋白(TP)数值明显降低，门冬氨酸氨基转移酶(AST)数值明显升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 甘油对大鼠生化指标的影响(n=6)

2.2 血常规及血凝指标

血常规指标检测结果见表2，与同性别对照组比较，甘油试验组动物红细胞(RBC)数值明显降低，血小板(PLT)数值明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。血凝结果显示，与对照组比较，甘油试验组各项数值未见明显变化，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表2 甘油对大鼠血常规和血凝指标的影响(n=6)

2.3 尿常规指标

尿常规检测结果见表3，与同性别对照组比较，雌性试验组动物尿比重(SG)数值明显著降低，甘油试验组动物在酮体(KET)、潜血(BLD)及尿蛋白(PRO)出现阳性指标增加，其他指标基本正常。

表3 甘油对大鼠尿常规指标的影响

2.4 组织病理变化

试验组大鼠肾小管扩张明显，可见肾小管中透明管型与血红蛋白管型。试验组大鼠肝血窦略微扩张，存在轻度空泡变性。对照组与试验组大鼠脾脏正常，未观察到明显的损伤(图1)。

图1 甘油染毒48 h后SD大鼠肾、肝和脾脏组织切片HE染色观察病理学变化(×400倍)

3 讨论

甘油肌肉注射造模可模拟过度训练导致的横纹肌溶解和急性肾损伤，其造模效果确定、方法简单、可重复性高，因此被广泛应用[7]。在以往的研究中我们发现，甘油注射的SD大鼠产生血尿，这表明有红细胞的溶解。作为红细胞较多的组织，肝与脾脏是否也会受到不同程度的损伤还有待进一步研究。在进行动物性别选择时，发现虽然均采用了甘油肌肉注射模型，但对于不同甘油肌肉注射模型动物性别的选择也千差万别，有采用单一性别进行试验[5-6]，也有雌雄混合进行试验[8]，但是并未说明选择相应性别的理由。由于激素分泌及基因不同造成了不同性别动物对某些模型的表现不同[9-11]，为了降低试验因素的干扰，因此本文对雌性和雄性动物分别进行试验，在脏器损伤的基础上进一步对性别的选择进行研究和探讨。

作为常用的急性肾损伤造模方法，大鼠采用50%甘油生理盐水按照10 mL/kg剂量两侧后肢注射造模的效果已被证实，并有较多文献支持[2，12-13]。因此在本次研究中选用50%的甘油按照10 mL/kg的剂量注射大鼠后肢肌肉的方式建立肾损伤模型。肌肉注射甘油后可见血尿的形成，由于观察时间间隔长，未能记录准确时间，会在后续的研究中准确记录。其中血尿的发生与甘油对横纹肌溶解的致病机制有关[14]，这表明在该模型中也存在其他组织或器官的损伤，储存有大量血液的器官如肝、脾等可能会受到较大的影响。从本文检测结果中可以发现肝脏产生了轻微的损伤，但是不如肾脏损伤明显，这可能是因为甘油对注射局部肌肉产生的红细胞溶解只是因为甘油的高渗性，这也导致了血小板浓度的增高并且48 h的试验时间还不足以引起其他脏器的广泛损伤，其中血生化及尿常规中肌酐、尿素氮及尿蛋白的显著提高也表明了肾功能损伤严重。对于甘油肌肉注射模型，从本次试验的生理指标及病理变化中可以看出雌性比雄性会产生更明显的病理变化，这可能是因为雄性分泌的雄激素能对肾损伤产生一定的保护作用。有证据表面，睾丸切除术加重了甘油引起的肾脏损伤，而睾酮降低了肾小管的坏死，减轻了肾损伤[15]，表明雄激素有一定的肾保护作用，因此特定的病理模型中选择雌性动物会有更好的表现。

综合以上结果，我们得出甘油注射大鼠后肢肌肉模型中，肾损伤明显，肝也发生了轻微的损伤。同时我们推测雄激素对甘油致急性肾损伤有一定保护作用，但具体的保护作用及机制有待于进一步研究。现采用的注射剂量是常用剂量，该模型产生的损伤程度是否随着使用甘油浓度不同而有所改变；随着试验时间的延长，实验动物的恢复时间还需要确定，这些问题会在后续的研究中进一步探究。