基于数据挖掘和分子对接技术探讨中药抗再灌注损伤的用药规律

徐方飚， 赵 哲， 谢 抗， 王新志

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450000；2.广东药科大学中医药研究院，广东 广州 510006；3.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

再灌注损伤存在于心脑血管、肝肾脏、子宫移植等疾病变化过程中[1-4]，是缺血后恢复血流，使得相关组织细胞在再灌注过程中进一步受到的损伤[5]。在心血管疾病中，由于再灌注后改变了血管内皮细胞结构，使得血管消除阻塞后仍不能完全实现组织血液灌注，严重时可表现为心肌功能障碍、血流微循环障碍等危及生命的病理现象。在脑缺血再灌注中，大量免疫细胞会在损伤部位聚集，并在短时间内大量释放细胞分裂素和氧自由基等物质，能够直接损伤内皮细胞，从而造成内皮结构和功能的损伤[6]，肝脏中再灌注损伤病理机制根据目前研究主要在无氧代谢、氧化应激等方面[7]，肾脏中病理机制如内皮细胞损伤、炎症反应等[8]。中药对于减轻缺血再灌注损伤是全面的，含括减少自由基、控制炎症反应等等多方面[9-10]。

中药在再灌注损伤中的病理机制已有一定的基础，涉及通路[11]、抗氧化、抗神经细胞凋亡[12]、药代动力学[13]等方面。本研究旨在通过现有知识结构及数据库构建缺血再灌注损伤机制核心靶点与中药成分及中药的网络关系，利用数学思维帮助基础实验及临床上中药选择，补充中医基础理论的现代医学证据以及开拓新药研发思路。

1 材料与方法

1.1 再灌注损伤靶点获取 通过检索文本挖掘数据库、Genecards数据库(https://www.genecards.org/)、Disgenet数据库(https://www.disgenet.org/)，以“reperfusion injury”为检索词，获取再灌注损伤相关靶点，并作取交集处理，作为关键靶点。取交集的做法能够一定程度的缓解不同数据库信息不对等的状况，并对获得关键靶点输入Unipot数据库(https://www.uniprot.org)由Gene symbol转换成蛋白名称。

1.2 蛋白互作网络构建及筛选核心靶点 将关键靶点输入STRING数据库(https://string-db.org)中，蛋白种类设置为智人(Homosapiens)，证据评分(minimum required interaction score)选取最高评分0.9分，获取蛋白相互作用关系。将获取的蛋白互作网络(protein protein interaction network，PPI)输入Cytoscape 3.7.2软件中可视化呈现及拓扑分析后获取核心靶点。

1.3 构建“化合物-核心靶点”网络 检索TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，收集与核心靶点相关的化合物，并以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug likeness，DL)≥0.18筛选化合物后[14-16]，导入Cytoscape 3.7.2软件中构建“化合物-核心靶点”网络，同时保存化合物对应中药及化合物分子结构。

1.4 构建“核心靶点-化合物-中药”网络 通过Cytoscape 3.7.2软件中的Merge插件融合“核心靶点-化合物”和“化合物-中药”网络，最终可视化“核心靶点-化合物-中药”网络。

1.5 核心靶点与化合物对接验证 在RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中检索并下载核心靶点3D结构，利用Autodock 4.2.6软件进行分子对接，进一步评估核心靶点与化合物之间的联系[17]。

1.6 数据挖掘 参照“十二五”规划教材《中药学》[18]及2020年版《中国药典》，获取核心靶点对应中药的性味归经，利用Origin 2019b绘图软件绘制柱状图、散点图和条形图。

2 结果

2.1 再灌注损伤靶点筛选 经过Genecards数据库和Disgenet数据库检索、比对后，共获得85个关键靶点，见图1。

2.2 蛋白互作网络构建及核心靶点筛选 为了明确85个关键靶点中的核心靶点，利用STRING数据库获取关键靶点的PPI网络，并导入Cytoscape 3.7.2软件可视化后利用Cytohubba 0.1插件对网络拓扑分析，以获取度值不小于中位数2倍，即度值不小于18的靶点为核心靶点。共获得6个核心靶点，按度值从大到小依次为STAT3(度值26)、JUN(度值24)、TNF(度值24)、RELA(度值19)、IL1B(度值19)、IL6(度值18)，见图2。图中关键靶点蛋白互作网络黄色节点为核心靶点蛋白互作网络，节点颜色越红则靶点度值越高。

2.3 “化合物-核心靶点”网络构建 通过对TCMSP数据库的全面检索，共得到41个经口服利用度和类药性筛选后的化合物与6个核心靶点相对应，将对应关系导入Cytoscape 3.7.2软件构建“化合物-核心靶点”网络，见图3。图中核心靶点为菱形，化合物为六边形节点，节点大小以该节点度值为标准，即度值越大，节点越大。

2.4 构建“核心靶点-化合物-中药”网络 为了更好的了解中药与成分与靶点之间的联系，利用Cytoscape 3.7.2软件构建“核心靶点-化合物-中药”网络图，见图4。由于中药数量较大，不便于观察，节选中药度值不小于4的中药进行网络构建。6个靶点度值代表所对应的成分个数，依次为转录因子p65(RELA，度值26)、肿瘤坏死因子(TNF，度值19)、转录因子AP-1(JUN，度值14)、白介素6(IL6，度值12)、白介素1β(IL1B，度值7)、信号转导子和转录激活子3(STAT3，度值4)。度值排名前5的成分为β-谷甾醇(MOL000358，度值246)、槲皮素(MOL000098，度值193)、山柰酚(MOL000422，度值136)、木犀草素(MOL000006，度值97)、异鼠李素(MOL000354，度值41)，41个化合物信息见表1。中药度值不小于5的有45个，条形图见图5。

表1 化合物信息及度值

2.5 分子对接结果 通过TCMSP数据库获取41个成分结构，利用RCSB PDB数据库获取STAT3、TNF、JUN、IL1B、RELA、IL6分子结构，pymol 2.3.1去除水分子和自身配体，AutoDockTools-1.5.6软件进行分子对接。小分子化合物与蛋白之间相互作用的强度可用结合力(Affinity)表示，Affinity值越低，结合力越强[19]。若结合力<0 kcal/mol，表明配体分子能与受体蛋白进行自发的结合[20]。结合力热图见图6，图中颜色越红则结合力越强。聚类归整后，STAT3与41个成分整体结合力较高，IL1B与RELA较为相似，IL6与TNF较为相似，故这两组聚类在一起，JUN则整体最低。为了更好地展现各靶点分子结构，在这6个靶点中选取各自结合力最强的，展示其结合构象的2D与3D展示图像，见图7。构象2D图中，链接的红色虚线为疏水作用，绿色虚线氢键作用，字母代表结合位点的氨基酸，氢键作用力与氨基酸残基之间的疏水作用力是结合稳定的主要存在。

2.6 中药性味归经频数统计 共收集381味中药，大部分中药均有入肝经的功效，苦、寒药居多，见图8～9。中医在治疗时的理念是整体论治，而本研究对象为再灌注损伤，其可以出现在全身多个部位，同时本次统计结果包含所有十二正经，符合疾病本身病理特性，符合中医整体论治的理念。归三焦经的两味中药分别是香附与栀子，同时，这2味中药的度值分别为5、3，成分中与香附有联系的为MOL000006、MOL000098、MOL000354、MOL000358、MOL000422，与栀子有联系的为MOL000098、MOL000358、MOL000422。所含成分根据TCMSP数据库可调控除STAT3外的5个核心靶点，但通过分子对接显示，它们与STAT3靶点的结合力较好，不排除结合的可能性，有待进一步验证。

3 讨论

再灌注损伤可以发生在全身各个脏器中，造成的连锁反应给予疾病恢复等各方面一定程度的打击。目前，对于再灌注损伤的机制研究趋于完善，治疗上受限于发病机制较多，结合患者个人体质原因复杂，西药的单一成分、单靶点及常规输液治疗方式起到的治疗效果有限。中药中成分多，多靶点多通路，同时对多种发病机制的共同干预，治疗方式以口服汤药为主要，并且已有一定的临床疗效及病理基础研究[21-22]。本研究通过符合中药多靶点多机制干预特性的网络药理学方法，构建靶点到中药成分之间关系网络，经过分析统计后，总结出中药在减少再灌注损伤的用药规律。

白果、菊花、葫芦巴、木蝴蝶和山豆根调控多个再灌注损伤的核心靶点。现代药理学对于白果，既银杏成熟种子的基础研究较多，发现其具有抗氧化作用，在神经系统疾病中研究与应用较多，能够促进脑部供血，改善痴呆患者学习记忆能力，同时能够减少脑组织损伤，保护神经功能[23]。菊花中多成分[24]、多部位[25]均具有抗氧化作用，张永利等[26]发现，在抗视网膜缺血再灌注损伤的兔模型中，菊花通过影响SOD、MDA活性，从而达到减少再灌注损伤的功效。就成分而言，多成分已发现具有抗氧化作用，如槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素[27-30]。

本研究对6个核心靶点及41种成分进行高通量的分子对接模拟，结合能热图显示，它们均有良好对接，并且达到具有一定的结合活性标准。其中STAT3与41种成分整体对接活性较高，但目前关于此靶点的中药作用机制研究较少，TCMSP数据库中仅有4种成分、8味中药证实能够调节此靶点，同时STAT3是PPI网络中度值最高的靶点，提示其可作为潜在有效的治疗靶点。STAT3在心脏、大脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾脏和胰腺均有表达，是信号转导子和转录激活子，能够介导细胞对白介素和一些列生长因子的反应[31]。JUN与41种成分结合整体偏低，考虑与JUN自身蛋白结构有关，其蛋白结构是长条型蛋白，空间交错较少，这意味着与小分子的结合均在蛋白结构的表面结合。结合力热图中，花生四烯酸与6个核心靶点结合力均处于勉强能够结合的状态，与自身复杂结构一定关系。花生四烯酸可调节多种炎症因子表达，同时其代谢通路亦影响多种炎性因子水平[32]。任越等[33]利用药效团模型，基于花生四烯酸代谢通路匹配出适合应用于抑制炎症风暴的药物，与本研究中的成分多数重合。

中医认为肝藏血，再灌注损伤相关中药归肝经居多，基于此，本研究认为药物代谢与这中间具有一定的联系。目前有研究表明，药物代谢与肝药酶有关，亦可从此角度来探讨中药归经的物质基础。此外，归经频数统计发现，大多数中药亦涉及肺经，肺主治节，朝百脉，具有宣发和肃降的作用。肝与肺均对全身气血运行起到重要调节作用，再灌注损伤发生的场所大多处于脉内，气摄血于脉内，肝脏与肺是人体气机，提示再灌注损伤中的物质基础与中医中气概念的存在一定的联系。

综上所述，本研究利用网络药理学技术，以再灌注损伤相关靶点作为出发点，探寻中药减少再灌注损伤的潜在物质基础及一般应用规律，为中医理论现代化研究提供了新的切入点，也为进一步基础研究深入开发可减少再灌注损伤的天然制剂提供思路，还可为中西医结合治疗再灌注损伤的用药提供借鉴。