红豆树异黄酮类成分抑制番茄灰霉病菌的活性研究

潘镇泽，傅佳蕊，郑 威，耿帅丽，张琳婧，徐会有，倪 林,2

（1.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002；2.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意义】番茄灰霉病主要由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染所致，是一种普遍性的真菌病害[1]，可引起烂苗、烂果等，造成番茄产量减少20%～40%，严重影响产量和品质[2]。目前该病害防治以化学农药为主，引发的残留超标、耐药性及环境污染等问题日益突出[3]。寻找合适的植物源抑菌剂、减少环境污染、确保食品安全成为当前亟需解决的关键科学问题[4]。【前人研究进展】红豆树（Ormosia hosiei）隶属于豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papilionoidee）红豆属（Ormosia），常绿或半落叶乔木，又名鄂西红豆、顾山红豆等，植物资源丰富[5]。红豆树富含黄酮、生物碱、木脂素等成分[6]。本课题组首次发现红豆树提取物对番茄灰霉病菌具有良好的抑制作用，经系统的分离、纯化和鉴定，获得异黄酮20种[7-9]。【本研究切入点】异黄酮类化合物抑菌研究多集中在医药或食品领域，关于对异黄酮类化合物植物病原真菌抑制作用和构效关系少有报道。【拟解决的关键问题】采用生长速率法[10]对红豆树异黄酮化合物的抑菌活性进行筛选，并对抑菌活性较好、含量较高的代表性异黄酮鹰嘴豆芽素A的作用机制进行初探，以期为植物源抑菌剂的开发和红豆树提取物利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 供试植物与供试病原菌 红豆树（Ormosia hosieiHemsl.& E.H.Wilson）于2017年4月采自福建省福州市晋安区，供试部位为枝条。实验室分离的异黄酮类化合物如表1、图1所示。

表1 红豆树异黄酮单体化合物Table 1 Isoflavone monomer of O.hosiei

番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）由福建农林大学农药学教育部重点实验室提供，菌种保存于福建农林大学植物保护学院农药与制药工程系样品室。

1.1.2 试验器材 SW-CJ-2FD超净工作台（苏州净化设备有限公司），PRX-250B智能人工气候箱（宁波赛福实验仪器有限公司），DGL-50B立式高压灭菌锅（江苏登冠医疗器械有限公司），HH-2数显恒温水浴锅（常州越新仪器制造有限公司），IKARV8V旋转蒸发仪（德国IKA集团），移液枪（苏昌艾仪器公司）KQ-250DB数控超声波清洗器（昆山市庆泰科技有限公司）。

1.1.3 试验试剂 工业酒精（福州艾市佳科技有限公司）；甲醇、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司）；马铃薯、离体番茄（市售）；葡萄糖、琼脂粉（上海神尚科技公司）；纯水、超纯水（实验室自制）。

1.2 试验方法

1.2.1 红豆树提取物及异黄酮单体化合物抑菌活性的测定 采用菌丝生长速率法测定抑菌活性。红豆树提取物含量为2.0 mg·mL-1，20种单体异黄酮纯化合物终浓度为75 μg·mL-1，配置含药PDA培养基，以同样溶解条件的溶液作为空白对照。用打孔器（孔径0.5 cm）打取菌丝外圈生长合适的菌饼，每个处理组设置3个重复，于培养箱中培养3～5 d。菌丝生长抑制率按如下公式计算。

式中，D1为对照菌落直径，D2为处理菌落直径。

1.2.2 鹰嘴豆芽素A对植物病原真菌毒力测定 将鹰嘴豆芽素A配制成最终质量浓度为25、50、100、200、400 μg·mL-1的含药 PDA 培养基。将市售药丁子香酚（0.3%）作为阳性对照，设置成相同浓度的对照组，按照1.2方法评价测定抑制真菌活性，计算毒力回归方程、有效中浓度（EC50）和相关系数（R2）。

1.2.3 鹰嘴豆芽素A对菌丝形态影响的观察 在无菌条件下，用接菌针分别取处理组和对照组培养皿边缘菌丝，放置于载玻片中央，加入适量乳酸酚棉蓝染色液进行染色，盖上盖玻片，在生物显微镜物镜（100×1.25，涂有香柏油）条件下观察菌丝形态。

1.2.4 鹰嘴豆芽素A对菌丝干重的影响 将鹰嘴豆芽素A分别配制成最终质量浓度为25、50、100、200、400 μg·mL-1的PD培养基，使用生长合适的番茄灰霉病菌菌株，取5个菌饼接入培养基中，设置不加药的PD培养基作为空白对照。将培养基置于振荡培养箱中（28 ℃，110 r·min-1）培养 6 d，然后把培养后的菌丝干燥、称重。

1.2.5 鹰嘴豆芽素A对菌丝生理生化指标的测定

（1）菌丝体提取物的制备。用打孔器（孔径0.5 cm）打取5个生长状态合适的番茄灰霉病菌菌饼，接入PD培养液中，置于振荡培养箱中培养6 d，收集菌丝，用灭菌超纯水冲洗2遍，并抽滤干燥。配制鹰嘴豆芽素A为100 μg·mL-1，取药液25 mL，加入1 g病菌菌丝，设置不加药的蒸馏水作为空白对照。28 ℃条件下，分别收集1、6、12、18、24 h后的菌丝。取各个时间段收集得到的0.4 g菌丝，加入2 mL Tris-HCl缓冲液研磨，1 000 r·min-1离心 10 min，取菌丝提取液的上清液备用。

（2）通过硫代巴比妥酸法[11]测定番茄灰霉病菌的丙二醛含量。取菌丝提取液的上清液加入2 mL 0.5 %TBA溶液反应，沸水浴加热10 min，取出待溶液冷却后10 000 r·min-1离心10 min。设置0.5 %TBA溶液为空白对照，分别测定450、532、600 nm处的吸光度值，计算丙二醛含量。通过硫代巴比妥酸法[11]测定番茄灰霉病菌的丙二醛含量。取菌丝提取液的上清液加入2 mL0.5 %TBA溶液反应，沸水浴加热10 min，取出待溶液冷却后10 000 r·min-1离心10 min。设置0.5 %TBA溶液为空白对照，分别测定450、532、600 nm处的吸光度值，计算丙二醛含量。

（3）鹰嘴豆芽素A对番茄灰霉病菌还原糖含量的影响。通过DNS法[12]（3.5-二硝基水杨酸法）测定还原糖的含量，取0.1 mL不同时间处理鹰嘴豆芽素A处理的菌丝提取液的上清液加入2 mL 3,5-二硝基水杨酸，充分混合后，沸水浴加热5 min，取出待溶液冷却后加入1 mL Tris-HCl缓冲液，设置不加药的蒸馏水作为空白对照。分别测定波长540 nm下吸光度值，计算葡萄糖含量。

（4）鹰嘴豆芽素A对番茄灰霉病菌保护酶活性影响的测定。通过紫外分光光度法[13]测定过氧化氢酶（Catalase，CAT）的活性。取1 mL不同时间处理鹰嘴豆芽素A处理的菌丝提取液，加入5%硫酸钛和浓氨水充分反应，3 000 r·min-1离心10 min，最后加入5%硫酸5 mL至沉淀完全溶解。设置蒸馏水为空白对照，分别测定各处理在240 nm处的吸光度值。

通过愈创木酚比色法[13]测定过氧化物酶（Peroxidase，POD）的活性。取100 μL不同时间处理鹰嘴豆芽素A处理的菌丝提取液，分别加入3 mL 0.05 mol·L-1的磷酸缓冲液（pH5.5）、1 mL 的 H2O2（1%）、1 mL 0.05 mol·L-1的愈创木酚溶液，37 ℃ 下水浴加热充分混合反应.设置蒸馏水为空白对照，分别测定各处理在470 nm处的吸光度值。

通过氮蓝四唑（NBT）法[14]测定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性。取1 mL不同时间处理鹰嘴豆芽素A处理的菌丝提取液，反应总体积为3 mL，依次加入50 mmol·L-1缓冲液、13 mmol·L-1甲硫氨酸（pH 7.8）、100 nmol·L-1EDTA 溶液、75 μmol·L-1NBT 溶液、2 μmol·L-1核黄素溶液充分混匀，设置蒸馏水为空白对照，分别测定各处理在560 nm处的吸光度值。

1.2.6 鹰嘴豆芽素A在离体番茄上防治效果 配制0.5、1.0和2.0 mg·mL-1的鹰嘴豆芽素A溶液。选取条件相似的番茄果实75%酒精消毒后用无菌水冲洗干净并用灭菌滤纸擦干。用手术刀在果实上划十字形伤口（伤口直径1.0 cm，深度0.1 cm），放入底部铺好湿滤纸的托盘。用0.5 cm打孔器取生长良好的番茄灰霉病菌菌饼，用接种针将带菌饼的菌丝面接在果实十字伤口的中央， 24 h后喷施0.5、1.0和2.0 mg·mL-1的药剂溶液及无菌水，置于25 ℃恒温恒湿培养箱保湿培养。

将处理好的果实培养10 d左右，在番茄病斑处垂直方向测量每个病斑的直径，使用以下公式计算鹰嘴豆芽素A的相对防治效果：

式中，S1为对照病斑面积，S2为处理病斑面积。

1.2.7 数据处理和分析 试验数据采用SPSS 26.0及Origin 9.1等软件进行分析处理，采用方差分析（AVOVA）分析个体处理之间的差异。经方差分析（AVOVA）确定，不同小写字母表示在0.05 水平差异显著。所有值均表示为3个重复的平均值+标准差（SD）

2 结果与分析

2.1 红豆树提取物及异黄酮类化合物的抑菌活性

红豆树提取物质量浓度为2.0 mg·mL-1时，抑菌率为67.25%。红豆树异黄酮单体化合物，在单体化合物质量浓度75 μg·mL-1时，其中鹰嘴豆芽素A和异樱黄素对番茄灰霉菌抑菌率相对较好，分别为46.74%和42.14%；澳白檀苷和4＇-甲氧基异黄酮-7-O-β-D-芹糖-（1→6）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等糖苷类异黄酮化合物抑菌率较低甚至无抑菌作用（表2）。

表2 红豆树提取物及单体化合物对番茄灰霉病菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of O.hosiei extract and monomer against B.cinerea

鹰嘴豆芽素A对番茄灰霉病菌的毒力如图2所示，EC50值为 203.189 μg·mL-1（表3）与阳性对照药丁子香酚（EC50=175.739 μg·mL-1）相当。

表3 两种化合物对番茄灰霉病菌的毒力测定Table 3 Toxicity of two compounds on B.cinerea

2.2 鹰嘴豆芽素A对番茄灰霉病菌菌丝形态的影响

通过显微镜观察番茄灰霉病菌丝，对照组菌丝表面光滑，透明饱满，大小均一，无断裂现象。处理组菌丝有明显的空泡化现象，相比于对照组透明度增加，排列杂乱，有内容物溢出现象。表明鹰嘴豆芽素A对番茄灰霉病菌存在明显毒害作用（图2）。

2.3 鹰嘴豆芽素A对番茄灰霉病菌菌丝干重的影响

处理6 d后，加入鹰嘴豆芽素A质量浓度为25 μg·mL-1时，菌丝干重的变化较为明显，相比于对照组菌丝干重明显下降；化合物浓度逐渐升高，菌丝干重逐渐降低；当鹰嘴豆芽素A质量浓度达到最大值400 μg·mL-1时，菌丝干重仅为对照组的57.01%，与对照组的菌丝干重差异显著，抑制率为42.99%（图3）。

2.4 鹰嘴豆芽素A对番茄灰霉病菌细胞膜的影响

番茄灰霉病菌细胞膜受损害后引起膜脂过氧化反应，丙二醛（MDA）就是其产物之一，其可以间接反映细胞膜受损程度。在鹰嘴豆芽素A质量浓度为100 μg·mL-1的条件下，细胞膜MDA含量随着处理时间的增加而不断升高，在18 h达到峰值（309.6 nmol·g-1），随后含量略有降低（图4）。处理组6～24 h细胞膜MDA含量均高于对照组且差异显著。表明鹰嘴豆芽素A可破坏菌体细胞膜，引起膜脂过氧化反应。

2.5 鹰嘴豆芽素A对番茄灰霉病菌还原糖含量的影响

使用鹰嘴豆芽素A处理番茄灰霉病菌后，处理前1 h，番茄灰霉病菌体内还原糖含量与对照组还原糖含量变化不大，6 h时，体内还原糖含量高于空白对照组，说明处理组菌丝受到外源刺激导致自身代谢糖物质以供生长需求；处理时间6～12 h时，处理组菌体内还原糖含量明显降低并低于对照组；12～24 h时处理组菌体内还原糖含量逐渐降低且趋于平稳，表明鹰嘴豆芽素A能够破坏细胞膜，使渗透性发生变化，导致胞内还原糖泄漏，随着处理时间延长，菌丝体胞内还原糖含量逐渐下降 (图5) 。

2.6 鹰嘴豆芽素A对番茄灰霉病菌CAT、POD、SOD活性的影响

图6显示，CAT活性在处理1 h内无明显变化；6 h后CAT活性迅速升高并在18 h时达到峰值，约为对照组的1.16倍；18～24 h该酶活性显著下降，并且低于对照组。而对照组CAT活性没有明显变化。图7显示，POD活性处理1 h内POD活性略低于对照组；1～6 h POD活性迅速升高并达到峰值，约为对照组的1.51倍；6 h后，POD活性显著下降。图8显示，处理1 h内SOD活性与对照组相比明显升高；1～12 h SOD高于对照组；12～18 h SOD活性急剧下降，至18～24 h SOD活性缓慢降低。表明番茄灰霉病菌经过鹰嘴豆芽素A处理后，菌丝体可以通过调节多种酶活性来减轻化合物对自身的毒害作用。

2.7 鹰嘴豆芽素A对番茄灰霉病菌在离体番茄上生长情况的影响

由表4可知，鹰嘴豆芽素A在离体番茄果实上对番茄灰霉病菌的防治效果较好，展现了对番茄灰霉病的预防以及治疗作用。药剂质量浓度为0.5、1.0和2.0 mg·mL-1时处理接菌后的番茄与对照组（病斑2.56 cm2）相比，明显抑制了菌丝生长，减小病斑的面积（1.90、0.51和0.21 cm2），且病斑直径随着药剂浓度的升高总体呈现减小趋势（图9）。而在先喷药后接菌的处理中，表现出相同的结果，尤其是药剂质量浓度为1.0和2.0 mg·mL-1时，预防效果明显（图10）。表明鹰嘴豆芽素A在离体番茄果实上对番茄灰霉病菌的具有良好的防治效果。

表4 鹰嘴豆芽素A在离体番茄果实上对番茄灰霉病菌的防治效果Table 4 Control efficacy of biochanin A against B.cinerea on tomatoes

3 讨论

本研究对红豆树种子乙酸乙酯提取物中分离的化合物进行抑菌活性筛选，将番茄灰霉病菌作为供试菌，用菌丝生长速率法对单体进行初筛，结果表明：在75 μg·mL-1质量浓度下，鹰嘴豆芽素A和异樱黄素的抑菌率高达42.14%和46.74%，抑制的毒力效果的EC50分别为 232.6 μg·mL-1和 203.2 μg·mL-1，略低于阳性对照丁子香酚（175.7 μg·mL-1）。提示含甲氧基的非苷类异黄酮成分是乙酸乙酯活性部位的主要抑菌成分。选取抑菌效果较好的鹰嘴豆芽素A作为代表性供试化合物，探索其对植物病原真菌生理生化的指标的影响，测定处理后的菌丝体干重、菌丝形态、电导率、MDA、还原糖及酶活性的变化，结果显示，其干重随药剂浓度增加而降低；处理后的菌丝生长受阻、形态受损、细胞内容物泄露；番茄灰霉病菌膜发生脂质过氧化反应，细胞膜渗透性发生改变，导致细胞质渗漏，菌丝体相对电导率增加，细胞膜MDA含量增加，还原糖含量先增后减；菌丝体细胞内CAT、POD和SOD酶的活性受到了干扰。此外，在离体番茄试验中，鹰嘴豆芽素A展现了对番茄灰霉病的预防以及治疗作用，且随着药剂浓度的增加，防治效果越好。

上述结果表明，异黄酮是乙酸乙酯活性部位发挥抑菌作用的主要成分，而异黄酮发挥抑菌作用的方式与其干扰菌丝体生长、损伤细胞膜功能以及降低胞内保护酶活性等有关。

黄酮类化合物是多酚类植物中广泛存在的代表性天然产物，其抑菌活性较强的特点吸引了众多天然产物农药学者的关注。相关文献报道，黄酮类和生物碱类化合物是豆科植物中的主要农药用活性成分，其中黄酮类化合物中的异黄酮多作为植保素，具有较好的抗菌活性[15]。本文从红豆树种子中分离的鹰嘴豆芽素A作为异黄酮类成分的一员，对番茄灰霉病菌表现出较好的预防和抑菌作用。前人研究表明，黄酮A环C-5、7位的羟基是重要的活性基团[16]，鹰嘴豆芽素A刚好具备这一特征，表现出优于其他黄酮的抑菌活性；此外，C环C-4＇位的羟基被甲氧基取代，或许对其抑菌活性有利。