脂肪干细胞及其衍生物促进糖尿病足再生修复的研究进展▲

黎洪棉 胡啸昊,2 王溪月,2 卢国浩 韦燕琳 吕立文 梁安儒 卢东长城 黎君君*

(1 广西医学科学院·广西壮族自治区人民医院科研实验中心，广西南宁市 530021；2 广西医科大学再生医学与医用生物资源开发应用协同创新中心，广西南宁市 530021；3 广西医学科学院·广西壮族自治区人民医院急诊科，广西南宁市 530021；4 广西康久生物科技有限公司，广西南宁市 530200；5 南宁维尔凯生物科技有限公司，广西南宁市 530300)

随着人们生活条件的改善和饮食结构的改变，我国糖尿病患者数量逐年增多。1980年的流行病学调查显示，我国糖尿病的患病率约为0.67%[1]。随后的40年间，我国糖尿病患者总数不断上升，2021年的数据显示我国糖尿病患者总数已增长至1.4亿例，相较于2011年的9000万例，增幅达56%，位居全球第一，形势严峻[2]。

糖尿病足是糖尿病患者严重的常见并发症之一，糖尿病患者有高达25%的机会发展为糖尿病足[3]，严重者将面临截肢的风险。糖尿病引发的低位远端截肢中，85%是由足部溃疡导致[4]。截肢有大小之分，小截肢是在清除感染和坏死组织的同时，通过重建部分血管或肢体矫正，有限地切除部分组织；而大截肢分为低位截肢和高位截肢，当无法通过血管重建、药物控制或小截肢控制病情发展时，需要通过大截肢治疗。研究表明，因糖尿病足住院的患者截肢率为11.4%，其中小截肢率和大截肢率分别为5.4%和6.0%，而需要二次截肢的患者比例为17.9%[5]。因糖尿病属于慢性进行性疾病，一些患者在糖尿病足初期症状较轻，缺乏日常护理意识，发病后不能及时就诊，待病情进展为糖尿病足溃疡期，或者伴随骨髓炎后才前往医院就诊，造成治疗难度加大[6]。而晚诊晚治不仅导致患者的生活质量显著降低，还会造成死亡率上升。糖尿病足创面难以愈合与内源性因素如代谢状况、血管、免疫功能、周围神经病变，以及外源性因素如感染、压力、软组织损伤等密切相关[7-8]。此外，许多潜在危险因素如年龄、吸烟、肥胖等，共同导致了糖尿病足创面难愈的复杂病理过程。既往治疗糖尿病足的方法较为单一，病理过程复杂的糖尿病足难以获得较好的疗效，导致患者需反复接受治疗，患者及家庭承受着极大的经济负担[9]。

近年来干细胞治疗作为一种新兴的治疗方法，逐渐应用于伤口愈合及组织修复治疗中。脂肪干细胞(adipose-derived stem cell，ADSC)具有多向分化及自我更新的能力，且其大量存在于脂肪组织中，易于分离提取，具有较强的体外增殖及分泌促血管生长因子的能力，是治疗糖尿病足理想的种子细胞[10]。同时，ADSC衍生物如外泌体与脂肪组织衍生物如基质血管成分凝胶被证实具有与ADSC相似的功能。基于上述优势，ADSC在糖尿病足的治疗中具有广阔的应用前景，有望成为治疗糖尿病足的新策略。

1 ADSC与脂肪组织及其衍生物概述

1.1 ADSC的分离、提取及应用 2001年Zuk等[11-12]通过脂肪抽吸手术从脂肪组织中获得脂肪组织提取物，发现脂肪组织提取物中的细胞具有多向分化潜能。次年，该研究团队首次从脂肪组织提取物中分离提取出ADSC。ADSC按来源分类属于成体干细胞，按功能分类属于多能干细胞。相较于骨髓间充质干细胞，ADSC具有获取容易、来源丰富、对机体损伤小等优势[13]。ADSC的经典分离方法是用胶原酶消化脂肪抽吸物，进行过滤及离心后获得基质血管成分，可进行传代培养。ADSC具有多向分化潜能，可以分化成为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等，适合体外大规模培养及自体移植[14-16]。研究表明，ADSC在伤口愈合、免疫调节以及抗凋亡中均有调控作用[17]。此外，ADSC技术的发展也为促进整形美容领域的发展带来了新思路，其能够改善皮肤光老化造成的皱纹，同时促进成纤维细胞合成胶原[18-19]。综上，ADSC已成为再生医学领域中重要的种子细胞，将发挥越来越重要的作用。

1.2 ADSC外泌体 ADSC外泌体为包含mRNAs、miRNAs和蛋白质等多种生物分子的盘状囊泡(直径30～150 nm)。外泌体通过释放蛋白质、脂质、DNA、RNA等在细胞间起到物质传输和通讯的作用[20-23]。目前最常见的ADSC外泌体的获取方法是将ADSC的培养液进行超高速离心后纯化提取。这种方法经济、实用且有效，能够最大限度地避免外泌体在提取过程中受到机械损伤。研究表明，ADSC来源的外泌体具有修复组织的潜力[24]，对治疗包括心、肝、神经系统和肾脏在内的各种疾病模型都有良好的效果[25-28]。与直接利用ADSC治疗相比，ADSC外泌体可以有效避免移植细胞遭受免疫细胞吞噬、细胞存活数量有限、衰老导致的细胞功能丧失及疗效不稳定等问题。

1.3 基质血管成分凝胶(stromal vascular fraction-gel，SVFG) 脂肪组织来源的基质细胞混合物，即基质血管成分也具有与ADSC相似的生物学功能[29-30]。SVFG是通过简单机械方法处理脂肪组织后获取的一种可注射凝胶状基质细胞复合物，由细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和ADSC、内皮细胞、周细胞、内皮祖细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等十多种细胞成分组成。在移植过程中，SVFG的ECM能够防止机体免疫系统攻击ADSC，为ADSC提供良好的生长环境。目前有较多关于SVFG治疗多种临床疾病取得良好疗效的报道，例如利用SVFG面部填充改善软组织缺损造成的外观问题，在痤疮病变真皮下注射SVFG可显著减少痤疮丘疹数量、改善鼻部增生性瘢痕，局部注射SVFG可促进慢性创面愈合等[31-33]。

2 ADSC与脂肪组织及其衍生物促进糖尿病足再生修复的机制

2.1 促进血管生成 ADSC在血管生成过程中起重要作用。2004年，Planat-Benard等[34]首次发现脂肪来源的谱系细胞和血管内皮细胞具有相同的前体细胞，有分化为内皮细胞表型、参与体内血管形成的潜能。之后的研究证明，脂肪组织中的ADSC可以通过向血管内皮细胞和平滑肌细胞定向分化直接参与新生血管形成[35]。相较于骨髓来源干细胞，ADSC分化为内皮细胞的能力更强[36]。将ADSC移植到损伤部位后，其分泌的细胞因子如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子-2、基质细胞衍生因子-1促进了新的肉芽组织和血管生成[36-37]。Pu等[38]将ADSC及其外泌体注入缺血再灌注损伤的皮瓣，术后第5天，相较于未接受ADSC及其外泌体治疗的组别，接受ADSC及其外泌体治疗的组别皮瓣存活率和毛细血管密度获得显著提升，证明ADSC和外泌体可以促进血管生成，且该效应是通过STAT3磷酸化途径致使白细胞介素-6表达实现的。此外，ADSC也可以作为辅助成分，与生长因子等成分同生物材料一起植入，起到促进受损伤的周围血管的生成作用[39]。

2.2 调节炎症反应 正常机体受到外界病原体入侵时会启动炎症反应防御机制，以便及时清除坏死组织。这一反应能减少组织损伤的进一步扩展，同时促进损伤组织的修复。慢性创面的愈合大致可以分为四个连续的过程：止血期、炎症期、增生期和重塑期[40]。而糖尿病足的创面由于各种外源性和内源性因素的影响，导致伤口停留在愈合的某个阶段。糖尿病足创面停滞在炎症期时，炎性细胞及炎症因子的高表达会导致蛋白水解加剧，从而抑制创面愈合由炎症期向下一阶段前进，导致创面迁延难愈[20]。炎性细胞中的巨噬细胞在炎症发展及消退过程中起重要作用[41]。巨噬细胞有M1和M2两种表型，其中M1巨噬细胞起到促进炎症的作用，而M2巨噬细胞则有抵抗炎症的作用。白色脂肪组织中的M2巨噬细胞在肥胖人群中数量较多，且会向M1巨噬细胞极化。这些M1巨噬细胞会诱导一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子-α表达，从而导致胰岛素抵抗。

ADSC外泌体能够减轻创面炎症反应，从而促进伤口愈合。当ADSC外泌体被巨噬细胞吸收后，外泌体携带的活性信号转导与转录激活因子-3会上调精氨酸酶-1的表达，促使M1巨噬细胞向M2巨噬细胞极化，从而减轻炎症反应[42]。此外，ADSC可以通过抑制淋巴细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞的成熟与增殖来降低免疫应答，起到促进伤口愈合的作用[43]。研究发现，ADSC具有下调炎性因子表达的功能。董瑶等[44]建立小鼠创面模型，并在创面周围注射ADSC，发现在创面组织中许多促炎因子如单核细胞趋化蛋白-1、白细胞介素-6以及白细胞介素-1等表达下降，而抗炎因子如白细胞介素-10等表达上升。由此推断ADSC可以减轻创伤部位的炎症反应，进而促进创面愈合。糖尿病足创面会形成低氧的环境，而ADSC耐受低氧环境，并且能够在低氧环境中释放自由基清除剂、抗氧化物质、热休克蛋白等物质，以清除受损组织微环境中的毒素[6，45]。Wang等[46]利用低氧环境下培养的ADSC所分泌的外泌体治疗糖尿病小鼠，结果显示，与正常环境下培养的ADSC外泌体相比，低氧环境下ADSC所分泌的外泌体具有下调炎症因子白细胞介素-6表达的作用，并且这种下调作用要强于正常环境下培养的ADSC外泌体，由此推测在低氧环境下ADSC可能具有更好的抗炎效果。

2.3 调节成纤维细胞的增殖及迁移 成纤维细胞可以产生多种糖蛋白和细胞因子[47]，可以调控ECM的产生和降解过程。在创面愈合过程中，成纤维细胞可迁移至创面，通过有丝分裂大量增殖，促进毛细血管生成，形成新的血管网络，恢复损伤部位的血供。成纤维细胞在创面愈合的第4～5天开始合成并分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管、蛋白多糖、透明质酸、胶原和弹性蛋白等ECM成分共同形成肉芽组织取代血小板凝块，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件[40]。因此成纤维细胞在创面修复过程中起到非常重要的作用。ADSC及其外泌体通过调节成纤维细胞的增殖和迁移，以及在创面愈合初期刺激胶原表达而促进了慢性创面的愈合。糖尿病足溃疡创面的愈合时间较长，易导致瘢痕形成，愈合质量差[48-49]。ADSC外泌体可通过诱导人类成纤维细胞的增殖和迁移及胶原蛋白的合成来促进伤口愈合[19，50]。研究表明，应用ADSC外泌体治疗创面，在创面愈合早期可促进成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原的形成，而在愈合晚期则会下调胶原的表达，以抑制瘢痕组织的生长[51]。Hu等[52]研究发现，ADSC外泌体被成纤维细胞摄入后，能刺激成纤维细胞中神经-钙黏素、细胞周期蛋白、增殖细胞核抗原以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因的表达。Wang等[46]通过蛋白质印迹实验发现,与ADSC外泌体共同培养的成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达水平显著上调，且在低氧环境下培养的ADSC分泌的外泌体对成纤维细胞的上述作用更强。对正常和缺氧环境下培养的ADSC外泌体中的RNA进行高通量测序，并运用京都基因和基因组百科全书分析差异表达的基因比对，发现差异表达的基因富集于PI3K/Akt通路。使用PI3K/Akt抑制剂Ly294002对成纤维细胞进行预处理，发现在低氧环境下培养的ADSC外泌体诱导成纤维细胞增殖的效果减弱，提示在低氧环境下培养的ADSC外泌体调控成纤维细胞的增殖和迁移可能依赖于PI3K/Akt信号通路。基质金属蛋白酶是以ECM为底物的蛋白酶，ADSC的蛋白提取物可以抑制成纤维细胞基质金属蛋白酶-1的表达并上调成纤维细胞Ⅰ型胶原的表达，对ECM起到保护作用，进而促进创面愈合[49，53]。

2.4 促进创面再上皮化 创面愈合过程中的一个重要阶段是创伤组织的再上皮化。糖尿病足创面的迁延不愈是由于再上皮化未发挥相应的作用。此外，大量免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞等会集中在创面处，释放水解酶和氧自由基，导致组织进一步损伤。因此，促进创面及时再上皮化对于创面愈合非常重要。纤连蛋白可作为趋化因子诱导上皮细胞、成纤维细胞等向伤口处运动，促进上皮组织再生。Zhao等[41]使用ADSC治疗兔牙龈创面，发现创面中纤连蛋白的表达上调。角质形成细胞是表皮的主要成分，其可通过增殖、分化、迁移形成新的表皮，在上皮化过程中起关键作用。Sheng等[54]发现，移植的ADSC能够促进表皮细胞的增殖，进而使皮肤创面的表皮在愈合过程中变厚。袁方等[55]将人表皮角质形成细胞与ADSC共同培养，发现ADSC可促进人表皮细胞迁移。ADSC不仅可以促进表皮细胞增殖和迁移，同时其自身也可以分化为表皮细胞促进创面再上皮化。赵京禹[56]利用免疫荧光染色检测ADSC移植后的组织，发现ADSC可促进细胞角蛋白的表达，提示ADSC具有分化为表皮细胞，进而促进创面再上皮化的能力。邱尧等[57]在创面处理时局部注射ADSC，随后观察到ADSC分化为角质细胞。增殖细胞核抗原在细胞增殖的启动中起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。此外，有研究发现，相比于单纯将ADSC移植于小鼠创面，将ADSC与透明质酸一同移植于小鼠创面能较好地促进创面上皮化；术后15 d对创面皮肤的增殖细胞核抗原进行检测，发现单纯移植ADSC和ADSC与透明质酸联合移植的表皮和真皮中均有较多的核抗原阳性增殖细胞，而ADSC与透明质酸联合移植的增殖细胞核抗原的表达上调幅度高于单纯移植ADSC，表明ADSC对表皮和真皮再生具有促进作用，并且在进行ADSC移植时添加透明质酸对表皮和真皮再生的促进效果更显著[58]。

3 ADSC与脂肪组织及其衍生物治疗糖尿病足的临床应用

3.1 支架及仿生基质促进ADSC移植技术发展 提高间充质干细胞移植后的成活率是临床医生不断追求的目标，仿生基质和支架的出现促进了干细胞技术的发展，支架可以作为一种结构基，供间充质干细胞附着、增殖及分化。现阶段常见的支架材料有人脱细胞真皮基质、纤维蛋白胶、丝素壳聚糖、透明质酸、Ⅰ型胶原、人脱细胞羊膜等。马继中[59]使用人脱细胞基质羊膜作为ADSC的支架，将支架复合ADSC移植于创面，结果显示创面愈合速度显著提高。糖尿病可能影响脂肪组织来源干细胞促进创面愈合的能力。Kim等[60]比较了正常ADSC和糖尿病患者来源ADSC促进小鼠糖尿病创面愈合的能力，结果显示正常ADSC组的创面愈合率明显高于糖尿病ADSC组。Laiva等[61]研究发现，使用一种新型的胶原蛋白-硫酸软骨素支架(其携带有基质衍生因子-1α编码基因的复合纳米颗粒)，可促进糖尿病ADSC基质衍生因子-1α的表达，恢复ADSC的促血管生成能力。

3.2 ADSC联合水凝胶移植技术 虽然ADSC已被广泛地研究并应用于疾病的治疗中，但ADSC容易受到微环境的影响，而ADSC结合水凝胶技术则为解决这一问题提供了方案。水凝胶包埋ADSC后可将ADSC携带至相应位置，同时为ADSC提供微环境保护。ECM是由细胞分泌到基质中的大分子组成的复杂网络结构，在静态下具有支撑、连接、保水、保护、抗压缩等作用，在细胞的基本活动中发挥着重要的生物学功能。脱细胞外基质是细胞和抗原成分被去除的自然组织，其保留了原有的ECM结构，各种脱细胞外基质因免疫原性低、生物相容性好而成为常用的生物支架材料。Pu等[62]将人脱细胞脂肪组织加工成可注射的水凝胶，然后与ADSC均匀混合，成功制备了对温度敏感、4℃液态、37℃半固态的人脱细胞脂肪组织水凝胶。将ADSC植入人脱细胞脂肪组织水凝胶后，细胞在凝胶层中的存活率高且生长良好。将含有ADSC的水凝胶注射到裸鼠皮下，15 min后取材，样本显示原位凝胶化。这些结果表明人脱细胞脂肪组织水凝胶可以为ADSC提供移植和生长的环境。林凯桑[63]将Pluronic F127水凝胶联合ADSC移植于糖尿病大鼠溃疡创面，发现相较于单纯移植ADSC治疗，使用ADSC联合Pluronic F127水凝胶治疗后的大鼠溃疡创面愈合率及愈合速度明显提高。以上结果表明，ADSC联合水凝胶治疗糖尿病足有很大潜力，但目前关于ADSC水凝胶的研究大多是动物实验，临床研究报道较少。

3.3 ADSC膜片移植技术 细胞片作为一种无支架的组织工程技术，可避免支架植入体内发生的免疫排斥反应。将细胞在特殊培养基上培养，通过改变外界条件可使黏附在基底表面的细胞脱附，从而获得细胞片[64]。目前已有众多ADSC膜片应用于组织修复和皮肤创面愈合的相关研究。ADSC膜片的优点在于可分泌多种细胞生长因子，能够同时抑制炎症进展、促进血管及上皮再生，避免了单细胞悬液注射后细胞易发生吸收和扩散，难以留存于治疗部位的问题[65]，因此ADSC膜片有望成为治疗糖尿病溃疡创面的新方法。Hamada等[66]使用温度敏感性培养系统制备ADSC膜片，并评估了ADSC膜片促进创面愈合的效果。结果显示：将ADSC膜片与人工皮肤一起移植到糖尿病大鼠皮肤创面后，与未接受移植的大鼠相比，接受移植的大鼠皮肤创面血管密度增加、真皮增厚、创面愈合速度加快。Kato等[67]从正常大鼠腹股沟脂肪组织中获取同种异体ADSC，并使用细胞片技术创建ADSC膜片，然后将其移植到Zucker糖尿病肥胖大鼠的全层皮肤缺损创面。结果显示ADSC膜片分泌了大量的血管生长因子，同时移植的ADSC迁移到血管周围区域，并进一步整合进了新构建的血管结构中。以上研究结果表明ADSC膜片可以直接或间接地促进糖尿病创面愈合。

4 展 望

糖尿病的患病率在全球范围内快速上升，迄今还未得到有效控制[68]。当前，全世界的糖尿病患者已增长到5.37亿，形势严峻[2]。糖尿病足作为糖尿病的常见并发症，具有创面愈合缓慢，严重者甚至无法愈合的特点，给治疗带来了巨大的挑战[69]。此外，糖尿病足患者5年内死亡率是普通糖尿病患者的2.5倍[70]。糖尿病足的治疗费用高昂，且单一的治疗方法难以取得较好的治疗效果，患者的复发率较高[71]，因此需要深入探讨糖尿病足创面愈合的分子机制，寻找促进糖尿病足创面愈合的有效治疗方法。

ADSC具有自我更新能力和分化潜能，同时能调节免疫、分泌多种细胞因子、促进血管生成。本研究团队针对ADSC多向分化潜能及旁分泌功能进行了大量研究，成功诱导了ADSC的分化，如改良富血小板纤维蛋白可通过调节缺氧诱导因子-1和血管内皮生长因子促进ADSC的旁分泌功能和增殖[72]；基质细胞衍生因子-1α修饰可促进大鼠ADSC的迁移能力；成纤维细胞生长因子诱导PI3K/Akt信号通路可促进乳房ADSC的增殖和成脂分化等[73]。上述研究优化了ADSC的多向分化及旁分泌功能，为ADSC的研究及应用提供了新思路。

随着研究的深入，不断有文献报道ADSC在糖尿病足的再生修复中的研究及应用，考虑到免疫排斥反应，目前大多数ADSC是从自体脂肪组织中提取而来。然而有研究显示，使用同种异体的ADSC治疗糖尿病足创面也能取得较好的疗效，且未发现有免疫排斥及其他严重的不良反应，提示同种异体ADSC的治疗效果可能不亚于自体ADSC[74]。与移植ADSC治疗相比，ADSC外泌体具有不含活细胞、性质更稳定、便于储存、保质期长等优点。同时，ADSC外泌体可以避免细胞治疗带来的相关问题。因此ADSC外泌体作为一种无细胞疗法在组织修复再生方面具有广阔的应用前景。

然而，ADSC在疾病的临床治疗中仍存在着一些安全问题，例如由于干细胞是未分化细胞，致瘤性的问题尚待解决；此外，为降低治疗时可能出现的风险，如何最有效地提取ADSC，以何种方法储存以保证ADSC良好的活性等问题还需进一步探讨。综上所述，ADSC治疗糖尿病足创面有着巨大潜力，随着技术的成熟和发展，ADSC必定会为更多的糖尿病足患者带来福音。