不同品种猕猴桃果实采后糖酸组分及含量变化分析

2022-12-01 03:27毛积鹏卢玉鹏张小丽王小玲
陕西科技大学学报 2022年6期
关键词:熟期红阳采收期

毛积鹏, 高 柱,, 卢玉鹏, 陈 璐, 张小丽, 王小玲*

(1.江西省科学院 生物资源研究所, 江西 南昌 330096; 2.井冈山生物技术研究院, 江西 吉安 343016)

0 引言

猕猴桃(Actinidia spp.)是20世纪由野生到人工商业化栽培驯化最为成功的果树种类之一,富含维生素、矿物质、氨基酸、有机酸等对人体健康有益的代谢产物,因其独特的风味,已成为世界上最受欢迎的水果之一[1-4].中国是猕猴桃的原产国,同时也是全球最大的猕猴桃种植国家,种植区主要分布在陕西、四川、云南、贵州、江西等地,是适种地区农民脱贫致富的支柱产业[5].虽然全球范围内中国猕猴桃的产量稳居第一,年产量300万吨以上,但表观消费量均值仅230万吨左右,加工比例仅10%,贮藏比例不足20%.采后腐烂率高达20%~30%,商品化率小于60%,即买即食率10%以下[6].究其原因,主要是我国猕猴桃产业采后保鲜和品质提升技术落后、重采前轻采后等产业问题突出,从而影响了消费者口碑和市场竞争力[7].

可溶性糖作为水果风味的重要组成部分,在果实品质形成中扮演着重要的角色.果实中可溶性糖主要为蔗糖、果糖和葡萄糖,不同园艺作物或不同发育和成熟阶段果实的优势糖组分差异显著[8].例如,柑橘主要糖组分是蔗糖[9],苹果主要糖组分是果糖[10].有机酸也是决定水果风味的主要成分之一,在维持水果品质和营养价值方面起着重要的作用.水果中含有多种有机酸,但大多数水果只以其中一种或几种为主.例如,柑橘、草莓和菠萝等水果中的主要有机酸为柠檬酸;苹果、枇杷和梨等水果中的主要有机酸为苹果酸;猕猴桃中的主要有机酸则为奎宁酸和柠檬酸[11-13].

不同种类的猕猴桃在口感和营养品质方面存在较大的差异[14-16].本研究以我国选育的世界首个红肉品种“红阳”猕猴桃、首个实现商业化栽培的种间杂交品种“金艳”猕猴桃和新西兰“金果”猕猴桃三种风味差异较大的中华猕猴桃果实为研究材料,采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术方法对三种猕猴桃果实的可溶性糖和有机酸酸组分及其含量进行测定与分析.旨在为中华猕猴桃品种品质的评价及采后品质提升技术的开发提供一定的理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

分别于2021年的8月、9月和10月从江西省奉新县江西省科学院博士猕猴桃基地(E 114°45′,N 28°34′)采取供试的“红阳”、“金果”和“金艳”猕猴桃果实.每个品种随机选取30个大小均一的健康果实,运回实验室后选取15个果实去皮、去籽,冷冻干燥磨粉后于-80 ℃保存备用,其余15个室温放置软熟后(硬度0.8~1 kg/cm2)进行取样.每5个果实混合为一份样本,共3个生物学重复.

色谱级甲醇,异丙醇,乙腈,Merc公司;色谱级正己烷,标准品,德国CNW公司;色谱级甲酸,99%纯度的甲氧胺盐,吡啶和N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA),Sigma公司.

1.2 主要仪器

LC-MS/MS(OTRAP6500+)美国SCIEX公司;GC-MS(7890-5975C)美国Agilent公司;离心机(5424R)德国Eppendorf公司;球磨仪(MM400)德国Retsch公司;冷冻干燥机(Centri Vap)美国Labconco公司;多管涡旋振荡器(Mix-200)上海净信科技有限公司;超声清洗仪(KQ5200E)昆山舒美超声仪器公司;氮吹仪(XD-DCY-24Y)上海析达仪器有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 可溶性糖组分测定

样本制备参考Sun等[17]的方法进行改进,具体操作步骤如下:称取20 mg粉末样本于2 mL离心管中,加入500 μL提取液(甲醇∶异丙醇∶水,3∶3∶2),涡旋3 min, 冰水中超声30 min,4 ℃,14 000 r/min离心5 min;转移50 μL上清液至另一个干净的1.5 mL离心管中,并加入20 μL浓度为100 μg/mL的核糖醇内标溶液,氮吹并冷冻干燥后加入100 μL浓度为15 mg/mL的甲氧铵盐吡啶,37 ℃孵育2 h;随后加入100 μL的BSTFA,37 ℃孵育30 min得到衍生化溶液,取50 μL的衍生化溶液用正己烷稀释至1 mL,保存于棕色进样瓶中,用于GC-MS分析.

色谱主要条件:色谱柱为HP-5MS(30 m×0.25 mm × 0.25 μm),载气为氦气,不分流.程序升温条件:70 ℃ 保持1 min, 随后以30 ℃/min升温至112 ℃,再分别以15 ℃/min升温至175 ℃,3 ℃/min升温至190 ℃,35 ℃/min升温至240 ℃,10 ℃/min升温至280 ℃,传输线温度240 ℃,进样量为2 μL.质谱主要条件:溶剂切割时间为5.5 min离子源温度为230 ℃,电离电压为70 eV,以分辨率70 000进行全扫描,扫描范围为81~1 000 m/z,扫描周期为0.2 s

1.3.2 有机酸组分测定

称取50 mg粉末样本于2 mL离心管中,立即加入500 μL提前-20 ℃预冷的甲醇提取液,涡旋3 min.4 ℃条件下,12 000 r/min离心10 min,吸取上清液300 μL于1.5 mL离心管中,-20 ℃静置30 min,4 ℃条件下,再12 000 r/min离心10 min,取上清液200 μL于进样瓶中-20 ℃保存用于UPLC-MS/MS分析.

液相主要条件:色谱柱为ACQUITY HSS T3 (1.8 μm,100 mm×2.1 mm ),流动相A相,超纯水(0.05%甲酸),B相,乙腈(0.05%甲酸).梯度洗脱程序为0 min A/B为95∶5(V∶V),8~9.5 min A/B为5∶95,9.6~12 min A/B为95∶5,流速为0.35 ml/min,柱温40 ℃,进样量2 μL.质谱主要条件为:电喷雾离子源温度550 ℃,正离子模式下质谱电压5 500 V,负离子模式下质谱电压-4 500 V,气帘气为35 psi.

1.4 数据处理

通过 Proteowizard 软件(V.3.0.8789)将获得的原始数据转换成 mzXML 格式,随后利用 R(V.3.3.2)的 XCMS 程序包进行峰识别、峰过滤和峰对齐分析,利用Aglient Masshunte软件进行积分峰匹配.采用MultiQuant 3.0.3软件处理质谱数据,参考标准品的保留时间与峰型信息进行积分校正与定性分析,通过标准曲线对检出目标物进行定量分析.t检验用于含量差异显著性分析,采用Z-Score法进行数据归一化处理并利用MeV 4.8.1软件进行聚类分析.

2 结果与讨论

2.1 总离子流色谱图分析

猕猴桃果实可溶性糖和有机酸检测样本的总离子流色谱图分别如图1和图2所示.结果表明,可溶性糖和有机酸检测总离子流的曲线重叠性高,保留时间和峰强度高度一致,仪器稳定性高,检测结果可靠.可溶糖的出峰时间在11~25 min之间,有机酸的出峰时间0.5~5.0 min之间.可溶性糖和有机酸标准曲线的线性回归方程相关系数分别介于0.992~0.999和0.991~0.999之间(线性方程数据未列出).表明在设定的高效液相色谱条件下各种可溶性糖和有机酸组分的峰面积与其含量有较好的线性相关性.

图1 基于GC-MS分析的猕猴桃可溶性糖总离子流色谱图

图2 基于UPLC-MS/MS分析的猕猴桃有机酸总离子流色谱图

2.2 可溶性糖组分及含量差异分析

通过标样验证在3种猕猴桃果实中共鉴定到12种可溶性糖,主要为蔗糖、果糖和葡萄糖(如表1所示),这和其它果实中的主要可溶性糖组分基本一致[9,10,18].蔗糖、果糖和葡萄糖在3种猕猴桃软熟期的含量均极显著高于采收期(如表1所示).

表1 不同猕猴桃品种果实采收和软熟期可溶性糖组分及平均含量 (mg/g)

在采收期,蔗糖在“红阳”中含量略高于“金果”和“金艳”,葡萄糖在“金果”中的含量略高于“金艳”,而极显著高于“红阳”(p<0.001).果糖在“金果”和“金艳”中的含量无明显差异,但均高于“红阳”.在相应猕猴桃的软熟期,蔗糖在“金艳”中的含量高于“红阳”和“金果”,葡萄糖在“金果”中的含量高于“红阳”和“金艳”,这与采收期的结果一致;果糖在“金果”中的含量最高,但在“红阳”和“金艳”中的含量无明显差异(p>0.05).初步表明“红阳”果糖的积累可能主要发生在采后软熟过程中,采收期果糖含量只有17.623 mg/g,到而软熟期果糖含量高达 72.454 mg/g,其含量增加了4.11倍.

肌醇在3种猕猴桃软熟期的含量均低于采收期.海藻糖、阿拉伯糖和山梨醇在3种猕猴桃软熟期的含量均略高于采收期,与3种主要可溶性糖含量的变化结果一致.麦芽糖、半乳糖和鼠李糖在“红阳”和“金艳”软熟期的含量均高于采收期(如表1所示),在“金果”软熟期的含量则低于采收期.岩藻糖和木糖醇分别只在“红阳”和“金果”猕猴桃的软熟期被检测到.一种可能是岩藻糖和木糖醇分别在“红阳”和“金果”猕猴桃果实软化过程中才开始被逐渐合成.另一种可能则是这两种糖在对应猕猴桃果实采收期的含量低于GC-MS的检测下限.

2.3 有机酸组分及含量差异分析

在三种猕猴桃果实中共鉴定到31种有机酸,主要为奎宁酸、柠檬酸和苹果酸,其次是顺式-乌头酸、丙酮酸和泛酸(如表2所示).这与其它猕猴桃品种果实中有机酸的主要成分基本一致[15].“红阳”和“金果”中含量最高的是奎宁酸,其次是柠檬酸和苹果酸,而“金艳”采收期含量最高的是柠檬酸,软熟期含量最高的是奎宁酸.奎宁酸的含量在3种猕猴桃的采收期和软熟期无明显差异(p>0.05);柠檬酸在3种猕猴桃软熟期的含量均显著高于采收期(如表2所示);苹果酸在“红阳”软熟期的含量低于采收期,在“金果”软熟期的含量高于采收期,在“金艳”软熟期和采收期的含量则基本一致.这初步表明,柠檬酸降解可能是这三种猕猴桃果实采后酸度下降的主要因素.

表2 不同猕猴桃品种果实采收期和软熟期有机酸组分及平均含量 (μg/g)

顺式-乌头酸和泛酸在“红阳”软熟期和采收期的含量无显著差异,在“金果”软熟期和含量显著低于采收期,在“金艳”软熟期的含量则显著高于采收期(如表2所示).反式-乌头酸在“红阳”软熟期和采收期的含量无明显差异,在“金果”和“金艳”猕猴桃软熟期的含量则显著低于采收期(如表2所示).隐绿原酸和新绿原酸在“红阳”和“金艳”软熟期的含量高于采收期,在“金果”猕猴桃软熟期的含量则低于采收期.齐墩果酸在“红阳”软熟期的含量显著低于采收期,在“金果”和“金艳”软熟期的含量显著高于采收期.琥珀酸在“红阳”猕猴桃软熟期的含量显著高于采收期.酒石酸在“金果”和“金艳”软熟期的含量显著高于采收期,在“红阳”软熟期的含量显著低于采收期.戊二酸、没食子酸、甲基丁二酸、壬二酸、葵二酸和辛二酸在“红阳”和“金果”软熟期的含量均低于采收期,而在“金艳”软熟期的含量则均高于采收期.

肉桂酸只在“金艳”的软熟期被检测到,含量为148.865 μg/g.阿魏酸则只在“金果”的软熟期和“金艳”的采收期被检测到,其含量分别为0.039 μg/g和0.029 μg/g.丙酮酸、苯甲酸、水杨酸、莽草酸和牛磺酸在3种猕猴桃软熟期和采收期的含量无明显差异.以上初步表明,不同品种猕猴桃果实有机酸组分基本一致,但各组分的含量有明显差异.

2.4 糖酸比与聚类分析

除糖酸组分外,糖酸比(总糖/总酸)在很大程度上决定了果实风味.由表1和表2分析可得,软熟期“红阳”、“金果”和“金艳”猕猴桃的糖酸比值分别为11.36、9.7和10.9,虽然“金果”猕猴桃的总糖含量最高,但受有机酸含量的影响,其甜度最低.

对12种可溶性糖和含量较高的19种有机酸的含量数据归一化处理后分别进行聚类分析.结果表明:“红阳”、“金果”和“金艳”三种猕猴桃的可溶性糖和有机酸含量分别在采收期和软熟期被直观地聚类为两组(如图3所示).综合表明,三个品种的猕猴桃果实在采后软熟过程中的可溶性糖和有机酸的变化趋势是基本一致的.

图3 三种猕猴桃可溶性糖和有机酸含量的聚类热图分析( JY、JG和HY分别表示“金艳”、“金果”和“红阳”;1、2分别表示采收期和软熟期)

3 结论

本研究利用基于GC-MS和UPLC-MS/MS技术平台的代谢组学方法对“红阳”、“金果”和“金艳”三个品种猕猴桃果实采收期和软熟期的可溶性糖和有机酸组分进行测定与分析,结果共鉴定到12种可溶性糖和31种有机酸.采收期三种猕猴桃果实的蔗糖、果糖和葡萄糖含量无明显差异,软熟期则以葡萄糖和果糖为主.“红阳”和“金果”猕猴桃采收期和软熟期的有机酸均以奎宁酸为主,“金艳”猕猴桃采收期以柠檬酸为主,软熟期以奎宁酸为主.奎宁酸和苹果酸在三种猕猴桃果实软熟期和采收期的含量差异不显著,柠檬酸是影响猕猴桃果实采后酸度的重要因素.糖酸比分析结果表明“红阳”最甜,“金艳”适中,“金果”风味较淡.聚类分析结果表明三种猕猴桃的糖酸组分及采后的变化趋势基本一致,但各组分的含量差异明显.

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