基于群体感应相关菌群分析的HMBR膜污染控制研究

李 莹，刘 强，项 玮，李倩囡

（徐州工程学院环境工程学院，江苏 徐州 221018）

胞外聚合物（EPS）被公认为是造成膜污染的主要物质，研究表明可通过抑制生物膜的形成减少其含量〔1〕。目前，研究人员多采取优化反应器系统运行条件、改善膜的性质以及投加各种抗生物等措施防止生物膜的形成〔2-3〕，然而这些措施存在运行管理复杂或易导致抗药性细菌耐药性加强的风险〔4〕，因此，抑制生物膜形成的便捷、安全的技术方法亟待开发。

微生物群体之间存在群体感应（Quorum sensing，QS），其是指同一物种或者不同物种之间广泛存在由协调群落基因表达和行为的小分子化合物（统称为信号分子）介导的信息交流，从而在环境中使得某一或某一类物种产生竞争优势的现象。已有很多学者从污水处理反应器中筛分出了具有分泌和降解信号分子的菌株〔5-6〕，按照对信号分子的作用可以将所得菌株分为4大类：群体感应猝灭菌（即信号分子降解菌，QQ 菌）、群体感应菌（即信号分子分泌菌，QS 菌）、既能降解信号分子又能分泌信号分子的细菌（QQ＆QS 菌）和既不能分泌信号分子也不能降解信号分子的细菌。

复合式膜生物反应器（HMBR）由传统MBR 和悬浮填料有机组合而成，兼具活性污泥工艺和MBR工艺的优点，并且由于悬浮填料的添加，反应器拥有数量更多、种群更加丰富的微生物。前期研究结果表明，污泥龄（SRT）能显著影响HMBR 内部去除污染物相关菌群的群落结构〔7〕，由此推测SRT 也可能影响与信号分子分泌相关的菌群的分布，从而影响HMBR 中的群体感应强度，进而调节膜污染过程，但到目前为止，与此相关的研究尚较为缺乏。

本研究旨在保障污水处理效果的前提下，从SRT 对群体感应相关菌群（QQ 菌、QS 菌、QQ＆QS 菌）群落结构的影响出发，分析SRT 通过干扰群体感应系统抑制EPS 生成的机理，以期在HMBR 污水处理系统中建立一种新的膜污染控制策略。

1 材料与方法

1.1 试验材料、装置及运行参数

试验原水为某高校学生宿舍区生活污水，接种污泥为某污水厂二沉池的回流污泥。污水原水水质为：水温21.3～29.2 ℃，pH 7.2～7.8，COD-N、TN、TP 分别为（210.1～324.8）、（38.5～78.1）、（35.8～86.7）、（5.5～6.7）mg/L。

HMBR 反应器结构如图1 所示，其主要由活性污泥混合液、膜组件和悬浮填料3 个功能单元组成。原水通过原水泵抽吸进入系统内部，活性污泥混合液和附着在悬浮填料表面的微生物对污染物进行生化降解，之后在蠕动泵的抽吸作用下，经由膜的微滤过程完成系统出水。该反应器主体材质为有机玻璃，有效容积为1.0 m³。悬浮填料投加体积分数为50%。膜组件材料为聚偏氟乙烯，膜孔径为0.2 µm，膜总面积为1.0 m2，膜通量为10.0 L/（m2·h）。安装在底部的曝气头为整个系统提供DO，同时为膜组件提供切应力以减缓生物膜的附着。系统以间歇交替模式运行，运行4 min 暂停2 min，运行过程中实时监测真空表压力变化，在跨膜压差（TMP）达到20 kPa时对膜组件进行清洗更换。试验过程中控制该反应装置内部环境pH 为7.5 左右，DO 为4.0 mg/L，温度为20 ℃，SRT 分别控制在10、20、30 d，水力停留时间控制在10 h。

图1 HMBR 设备示意Fig.1 Schematic diagram of HMBR equipment

1.2 检测项目及方法

1.2.1 常规指标检测方法

采用哈希HQ30 d 分析仪测定DO、pH；采用快速消解法测定COD；采用纳氏试剂分光光度法测定-N；采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法测定TN；采用过硫酸钾消解-钼锑抗分光光度法测定TP。

1.2.2 高通量测序方法

采集3 个工况（SRT=10、20、30 d）下HMBR 膜表面、悬浮填料表面及活性污泥混合液中的活性污泥，混匀后置于无菌离心管中于-20 ℃冰箱内保存。送检时将所有样本置于盛有足够干冰的保温箱中，运送到相关专业机构进行DNA 提取和高通量测序，特异引物为16S V4～V5 序列。

采用二次扩增的方法提高目标DNA 的纯度，PCR 扩增体系的方法和参数同参考文献〔7〕中要求。

1.2.3 信号分子检测方法

鉴于信号分子分子质量较小，能够透过膜孔，故而假定HMBR 出水中的信号分子浓度与反应器中的信号分子浓度差异可以忽略。采用文献〔8〕中的方法对HMBR的出水进行固相萃取（SPE）富集，之后采用Aquity超高效液相色谱（UPLC）串联三重四级杆质谱（Xe⁃voTMTO MS，美国）检测反应器对信号分子进行定量分析，三重四级杆质谱需配置电喷雾离子源。

2 结果与讨论

2.1 SRT 对HMBR 去除污染物的效果及运行周期的影响

图2 不同SRT 下各污染物的去除情况Fig.2 Removal of pollutants under different SRT

由图2 可知，HMBR 在3 个工况下均具有良好的污染物降解效果。3 个工况下的出水COD、-N 均满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918—2002）一级A 标准要求（COD≤50，-N≤5），TN、TP满足二级标准要求（TN 不限制，TP≤5），且SRT=30 d 的工况下出水TN、TP 质量浓度最低。综合4 个指标来看，SRT 为30 d 的工况下HMBR 出水效果最佳。

不同工况下TMP 的变化规律见图3。

图3 不同SRT 下TMP 的变化Fig.3 Changes of TMP under different SRT

由图3 可知，随着SRT 的延长，TMP 上升到预设值20 kPa 的时间逐渐拉长，特别是当SRT 为30 d 时，TMP上升到20 kPa 的时间较SRT=10 d 时增加了1.1 倍，表明SRT 确实能够调控HMBR 内膜组件的污染状况，从而影响运行周期。先前也有研究表明，EPS 与SRT 紧密相关〔9〕，适当延长SRT 有助于控制EPS 的含量及成分组成〔10〕，从而减轻膜污染，延长运行周期。

2.2 HMBR 中群体感应相关菌群对SRT 的响应机制

已有研究表明EPS 及生物膜的形成受到群体感应的影响，下面将从与群体感应相关的菌群（QQ 菌、QS 菌、QQ＆QS 菌）角度对SRT 调控膜污染的机理进行分析探讨。

对3 个工况下（A 工况SRT=10 d，B 工况SRT=20 d，C 工况SRT=30 d）HMBR 反应器内部鉴别出的QQ 菌、QS 菌和QQ＆QS 菌的相对丰度进行统计，结果见图4。对图4 中的数据进行进一步分析，即将各样品中和群体感应相关的微生物分类求和得到总的QQ 菌、QS 菌和QQ＆QS 菌的相对丰度及其序列数，结果见图5。

由图4（a）可知，HMBR 反应器中检测到的QQ 菌主要有Anaerolineaceae（厌氧绳菌科）、Comamonas（从单胞菌科）、Xanthomonadaceae（黄单胞菌科）、Cloaci⁃bacterium（梭状芽胞杆菌属）、Chryseobacterium（金黄杆菌属）、Flavobacterium（黄杆菌属）、Pedobacter（土壤杆菌属）、Mesorhizobium（中慢生根瘤菌属）等。其中Comamonas、Xanthomonadacea 和Anaerolineaceae 相对丰度较大，随着SRT 的延长三者的相对丰度呈现出不同的规律。结合图5 所示的QQ 菌的相对丰度和序列数综合分析后发现，随着SRT 的延长，QQ 菌总数呈现先降低后上升的规律，即便当SRT=20 d 时QQ 菌相对丰度达到最低，但也到了10%以上，总序列数达到了55 350，说明HMBR 内部含有丰富的QQ 菌。QQ 菌分泌的qsdA 酶可以将N-酰化高丝氨酸内酯类化合物（AHLs）的内酯环水解以实现对AHL 的降解，由此可以推测HMBR 具有良好的猝灭信号分子能力，即具有良好的膜污染控制潜力。

图4（b）中的数据表明，HMBR 反应器内还含有丰富的QS 菌群，主要包括Rhodocyclaceae（红环菌属）、Nitrosomonadaceae_unclassified（未分类的亚硝化单胞菌科）和Thermomonas（热单胞菌属）等。随着SRT 的延长，Rhodocyclaceae的相对丰度呈现先降低又急剧升高的规律，而Nitrosomonadaceae_unclassified 的丰度出现明显下降的趋势。值得注意的是，Thermomonas虽然未被严格证实能够分泌或者降解信号分子，但是其对生物膜的形成亦有重大贡献，相对丰度随着SRT 的延长急剧下降。结合图5 可知反应器内部检测到的QS 菌总体相对丰度在SRT=20 d 时达到最低值5.6%，继续延长SRT 至30 d 时恢复到13.09%，但也低于同工况下QQ 菌的相对丰度（22.64%），同时，其与QQ 菌的序列数比也从0.707 降到0.579。这表明SRT 的延长虽然能同时促进QQ 菌和QS 菌的富集，但对于QQ菌的富集更具优势，因此可以认为延长SRT 有利于缓解膜污染。

图4 不同SRT 下群体感应相关菌群的相对丰度分布Fig.4 Relative abundances of quorum sensing related bacteria under different SRT

图5 不同SRT 下QQ 菌、QS 菌、QQ＆QS 菌的相对丰度分布及序列数Fig.5 Relative abundances and numbers of QQ bacteria，QS bacteria，QQ＆QS bacteria under different SRT

图4（c）给出了同时具有分泌和降解信号分子作用的菌群及其相对丰度的变化。由图4（c）可知，在HMBR 反应器内Thiothrix（发硫菌属）占据QQ＆QS 菌的绝对优势，其相对丰度的变化决定了QQ＆QS 菌的多寡。Thiothrix相对丰度在SRT=20 d 时达到了峰值14.76%，此时，其序列数为61 388，远远高于A、C 工况下的值，可知SRT 对QQ＆QS 菌的数量亦能够产生显著影响。

对图5 作进一步分析可知，QQ 菌和QS 菌的相对丰度及序列数均随着SRT 的延长先降低后增加，但QQ 菌的相对丰度始终高于QS 菌的相对丰度，特别是SRT=30 d 时二者的差值高达9.5%，QQ 菌与QS菌的序列数差值在SRT 为20 d 时最大，为32 134。因此，可以得知在HMBR 中，SRT 对这3 类细菌均能够产生显著影响，且在较长的SRT 下，QQ 菌的相对优势更加明显。

2.3 HMBR 中信号分子浓度对SRT 的响应机制

对各工况下处于稳定运行的HMBR 中的信号分子质量浓度进行测定，结果见图6。

图6 不同SRT 下HMBR 中信号分子的浓度Fig.6 Concentrations of signal molecules in HMBR under different SRT

由图6 可知，各工况下反应器中仅检测到C4-HSL、C6-HSL 和C8-HSL 这3 种短链信号分子，而长链信号分子由于比较容易被活性污泥降解，在HMBR 内未被检出。这3 种信号分子中，C4-HSL 和C8-HSL 2 种信号分子的质量浓度明显低于C6-HSL的质量浓度，C8-HSL 信号分子质量浓度最低，而且C4-HSL 和C8-HSL 浓度均呈现随着SRT 的延长逐渐降低的趋势，与QQ 菌相对丰度的变化规律一致；而C6-HSL 则随SRT 的延长呈现先升高后降低的趋势，与QQ＆QS 菌变化规律一致。因此可以认为，SRT 可以显著影响HMBR 反应器内QQ 菌、QS 菌和QQ＆QS 菌的群落结构，以此促进对C8-HSL 的降解，进而减缓生物膜的形成，最终达到控制膜污染、延长膜组件运行周期的目的。

3 结论

本研究对比分析了SRT 分别为10、20、30 d 条件下HMBR 对某高校学生宿舍区生活污水的处理效果，并探究了SRT 对群体感应相关菌群结构以及信号分子浓度的影响，得出以下结论：

（1）当SRT 分别为10、20、30 d 时，HMBR 均具有良好的污染物去除能力，且在SRT=30 d 的条件下HMBR 运行效果最佳。

（2）SRT 不仅影响污染物的去除效果，也能显著影响膜组件的运行周期，在研究范围内，较长SRT（30 d）工况下膜组件更替周期较长，具有更优良的操作潜力。

（3）SRT 能够显著影响QQ 菌、QS 菌和QQ＆QS菌的相对丰度，从而调控HMBR 系统内部信号分子的浓度，特别是较长的SRT 条件下，系统菌群能够有效降解C8-HSL 信号分子，进而降低生物膜的形成速率，通过非杀菌机制有效控制膜污染。